Abbiamo sviluppato un test di irritazione oculare, che utilizza un modello di tessuto tridimensionale ricostruito epiteliali della cornea, come l'essere umano (RHCE). Il test è in grado di discriminare tra irritanti oculari e materiali corrosivi (GHS categoria 1 e 2 combinati) e quelli che non richiede etichettatura (GHS nessuna categoria).
Per rispettare il settimo emendamento alla legislazione direttiva sui cosmetici e REACH EU, sono necessari metodi alternativi non animali convalidati per la valutazione affidabile e preciso di tossicità oculare nell'uomo. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un test di irritazione oculare (IET), che utilizza un modello tridimensionale ricostruito umano cornea simile epiteliale (RHCE) tessuto che si basa su cellule umane normali. L'IET è in grado di separare sostanze irritanti e corrosive oculari (GHS Categorie 1 e 2 combinati) e quelli che non necessitano di etichettatura (GHS nessuna categoria). Il test utilizza due protocolli separati, uno progettato per prodotti chimici liquidi e un secondo protocollo simile per articoli di prova solidi. Il modello di predizione IET utilizza un unico periodo di esposizione (30 min per liquidi, 6 hr per solidi) e un singolo vitalità del tessuto cut-off (60,0% come determinato mediante saggio MTT). Sulla base dei risultati di 83 sostanze chimiche (44 liquidi e 39 solidi) EIT raggiunto 95,5 / 68,2 / e 81.8% sensitivity / specificità e accuratezza (SS & A) per liquidi, 100,0 / 68,4 / 84,6% e SS & A per i solidi, e 97.6 / 68.3 / e 83,1% per la generale SS & A. L'IET contribuirà in modo significativo alla classificazione della potenziale di irritazione oculare di una vasta gamma di prodotti chimici liquidi e solidi, senza l'uso di animali per soddisfare i requisiti di prova regolamentari. Il metodo EpiOcular IET è stato implementato nel 2015 negli indirizzi di test OCSE TG 492.
I prodotti di consumo come i cosmetici, detersivi, detergenti per la casa e comprendono una serie di sostanze chimiche che possono indurre gravi danni se si mettono in contatto gli occhi. Pertanto, le prove di questi agenti per l'irritazione degli occhi è richiesto dalle agenzie di regolamentazione degli Stati Uniti e dell'Unione europea per garantire la sicurezza dei consumatori 1. Una valutazione del potenziale di irritazione oculare di miscele e formulazioni è anche un requisito per il rispetto REACH (Registrazione, valutazione, autorizzazione e restrizione delle sostanze chimiche) La legislazione per l'etichettatura degli ingredienti cosmetici ai sensi della direttiva europea sui cosmetici per il trasporto di prodotti chimici, e per l'etichettatura dei pesticidi e prodotti per la casa 2. Attualmente, le agenzie di regolamentazione richiedono valutazione del pericolo oculare con il sistema mondiale armonizzato di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche (GHS) 3. GHS si basa principalmente sulla prova di irritazione oculare Draize, il più utilizzato test di irritazione oculare in cui sostanze estranee e mixtures vengono introdotti direttamente nel sacco congiuntivale dell'occhio di coniglio 4. Secondo la classificazione GHS, GHS categoria 1 (corrosivi oculari) si riferisce per testare sostanze chimiche che causano gravi lesioni iniziale ai tessuti oculari o gravi danni agli occhi e la visione che non è completamente reversibile entro 21 giorni dopo l'esposizione 3,5. GHS categoria 2 si riferisce a testare le sostanze chimiche che producono cambiamenti significativi negli occhi che sono completamente reversibili entro 21 giorni di esposizione. Sostanze chimiche di prova che non sono corrosivi o irritanti sono indicati come GHS No Categoria.
Per più di 40 anni, l'esame degli occhi coniglio Draize è stato criticato per la sua mancanza di riproducibilità, sovrastima delle risposte umane, e l'uso di animali vivi 5-8. Queste preoccupazioni hanno spinto tante proposte per la raffinatezza, la riduzione e la sostituzione dei test in vivo 9. La necessità di alternative non animali convalidati è stata ulteriormente rafforzatacon l'adozione del settimo emendamento alla direttiva sui cosmetici, che ha vietato l'uso di animali nella valutazione della sicurezza dei prodotti cosmetici (nel 2005) e gli ingredienti (nel 2009) 2.
Dal 1996, il modello tessuto corneale come ricostruito è stato ampiamente utilizzato nell'industria cosmetica di valutare il potenziale di irritazione delle materie prime, formulazioni a base di tensioattivi, e miscele che sono progettati per l'uso in composto, o in prossimità del, l'occhio 10-13. L'utilizzo del modello di tessuto RHCE consente l'applicazione topica diretta del materiale di prova sulla superficie del tessuto nella sua forma non diluita nativa. In questo modo, le formulazioni non solubili in acqua possono essere testati senza diluizione con solventi. In risposta alle EURL di ECVAM (laboratorio di riferimento dell'Unione europea Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi) richiesta di un metodo ampiamente applicabile, semplice, ed economico oculare Test (IET), che utilizza un single il tempo di esposizione ed è in grado di separare sostanze irritanti oculari e corrosive da materiali che non richiedono l'etichettatura è stato sviluppato (Figura 1) 14. Sulla base dei risultati di 83 chimici (44 liquidi e 39 solidi), l'EIT raggiunto 95,5 / 68,2 / e 81,8% di sensibilità / specificità e accuratezza (SS & A) per liquidi, 100,0 / 68,4 / e 84,6% SS & A per i solidi, e 97,6 / 68.3 / e 83,1% per la generale SS & A.
Nel 2007, uno studio di pre-validazione multi-laboratorio sponsorizzato dalla Cosmetics Europe (ex Colipa) sotto gli auspici del ECVAM EURL ha valutato la rilevanza e l'attendibilità dell'IET con l'obiettivo di portare al 15 formale di convalida. In questo studio, 298 prove indipendenti sono state effettuate in sette laboratori indipendenti. I risultati dello studio hanno dimostrato accordo 99,7% in previsione con bassi coefficienti di variazione in tutti i laboratori partecipanti 15. Di conseguenza, nel 2010 il protocollo IET è entrato formale EURL ECVAMprogramma di convalida. Lo studio di validazione utilizzato 104 sostanze chimiche di prova codificati, comprese le sostanze individuali e miscele chimiche, per cui i dati in vivo di riferimento (Draize dati irritazione agli occhi) erano disponibili. Sulla base del successo di questo lavoro, un progetto di linee direttrici OCSE è stata presentata nel 2014. Si prevede che l'IET contribuirà in modo significativo alla classificazione di irritazione oculare potenziale una vasta gamma di materiali secondo il sistema di classificazione ed etichettatura GHS dell'ONU.
Abbiamo presentato l'oculare di prova (Figura 1) che è stato sviluppato per il modello di tessuto EpiOcular. L'IET è in grado di separare sostanze irritanti e corrosive oculari (GHS categorie 1 e 2), combinato con materiali che non richiedono etichettatura (GHS nessuna categoria), con alto grado di sensibilità e specificità 17. L'IET come presentato qui non discrimina tra GHS Categoria 1 da categoria 2 prodotti chimici. L'EIT è stato convalidato per la classificazione e l'etichettatura delle oculare potenziale di irritazione di una vasta gamma di sostanze chimiche, tra cui cosmetici e farmaceutici ingredienti. In concomitanza con altri test in vitro, l'EIT servire come un sostituto per l'occhio di coniglio test di irritazione in vivo.
L'IET utilizza due protocolli simili ma distinte per materiali liquidi e solidi, che variano nella durata dell'esposizione e periodi di incubazione post-esposizione (Figura 1). L'endpoint utilizzato nel IETè vitalità del tessuto, determinata con il saggio MTT, che è stato precedentemente utilizzato in validati modelli tessuti epiteliali umane 20,21. Per eseguire questo test, non è necessaria alcuna attrezzatura speciale oltre che delle apparecchiature standard di coltura cellulare. Dato l'elevato livello di riproducibilità-tessuto tessuto, n = 2 tessuti invece del solito raccomandato n = 3 servono. La possibilità di usare n = 2 tessuti è un aspetto critico del protocollo, in quanto permette ad un operatore esperto per processare simultaneamente due tessuti, riducendo al minimo la variabilità del test che possono sorgere a causa del diverso trattamento dei singoli tessuti 14. Inoltre, utilizzando n = 2 tessuti per articolo di prova, l'irritabilità di 10 sostanze di prova di uno stesso stato fisico (liquido o solido), insieme con i controlli positivi e negativi, può essere valutata utilizzando un kit (24 tessuti).
Altri punti chiave che garantiscono la classificazione affidabile di materiali sono specifiche per il controllo positivo substance (vitalità del tessuto ≤50.0%), la riproducibilità tra tessuti duplicati (differenza <20,0%), e letture OD controllo negativo (> 0,8 e <2,5).
Durante la prova IET, è importante rispettare il protocollo convalidato e al dosaggio suggerito e orari risciacquo (Tabelle 3 e 4), in quanto deviazione dal protocollo o cambiamenti nei periodi di incubazione può causare risultati alterata. Allo stesso modo, le deviazioni dal tempo 3 ore per MTT incubazione si tradurrà in letture diverse MTT e possono influire risultato del test.
Di tanto in tanto, una sostanza chimica di prova può avere proprietà ottiche o di altro tipo che possono interferire con il tessuto MTT viabilità saggio o la riduzione causa di MTT. Ad esempio, una sostanza chimica di prova può ridurre direttamente MTT in blu-viola prodotto di reazione, o può essere una sostanza colorata che assorbe la luce nella stessa gamma MTT formazan (~ 570 nm). Tuttavia, queste sostanze chimiche di prova saranno prESENT un problema solo, se al momento del saggio MTT, una quantità sufficiente di materiale è ancora presente (o assorbita) il tessuto. Per evitare questa interferenza, estese le procedure di lavaggio sono incorporati nel protocollo dell'IET. Se il risciacquo non rimuove il TA e TA interferisce con la riduzione MTT, controlli aggiuntivi devono essere utilizzati per individuare e correggere per esso. In breve, se si sospetta riduzione diretta MTT della sostanza chimica in esame, 50 ml (o 50 mg per i solidi) della sostanza chimica in questione è incubato per 3 ore con la soluzione MTT lavoro a SCC (NC, 50 ml di acqua deionizzata sterile, dovrebbe essere eseguire contemporaneamente). Se la soluzione MTT diventa blu-viola, l'articolo di prova si presume di aver ridotto la MTT. In questo caso la verifica funzionale mediante controlli tissutali freeze-ucciso deve essere eseguito per valutare se il materiale di prova è vincolante per il tessuto e porta ad un falso segnale di riduzione MTT. Se vi è la riduzione MTT sensibile del TA-esposto, controllo di tessuto ucciso(rispetto alla quantità nel tessuto vitale non trattato), la vitalità del tessuto medio del prodotto di prova deve essere corretto sottraendo la redditività media del controllo uccisi.
L'EIT sbaglia sul lato della sicurezza, come dimostrato dalla bassa incidenza di falsi negativi classificazioni 14,15,18. È importante sottolineare che nessuna delle categoria GHS 1 sostanze chimiche, che sono corrosivi per l'occhio e che rappresentano il più grave pericolo per gli occhi, sono stati classificati come non irritante in questo saggio 14,15,18,19. Infine, uno dei principali vantaggi del RHCE in metodo di prova in vitro è la possibilità di testare liquido pulito e materiali solidi (che non è possibile con le culture, bidimensionali cellulare in immersione).
L'IET contribuirà in maniera significativa a determinare il potenziale di irritazione oculare di una vasta gamma di materiali secondo il sistema di classificazione ed etichettatura GHS dell'ONU. La sostituzione degli animali per determinare oTossicità colare è stato un obiettivo della ricerca tossicologica per molti anni. Il metodo di prova EIT ha completato uno studio di validazione formale supportato da EURL ECVAM nel 2014 e la EpiOcular EIT è stato attuato negli indirizzi di test OECD l'OCSE TG 492 nel 2015.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. John Harbell per il suo sostegno scientifico e il tempo dedicato al progetto dell'IET. Gli autori desiderano anche ringraziare Beiersdorf AG (Germania), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble / Cosmital (Svizzera), Laboratoire Pierre Fabre (Francia), Harlan Laboratories (Regno Unito), e LVMH Parfume (Francia) per la partecipazione a Multi-Centro internazionale Pre e alla convalida Studi del Irritazione agli occhi di prova 15.