Nós desenvolvemos um teste de irritação nos olhos que utiliza um modelo de tecido tridimensional epitelial córnea-like humana reconstruída (RHCE). O teste é capaz de discriminar entre irritante ocular e materiais corrosivos (GHS Categorias 1 e 2 combinados) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria).
Para cumprir com a Emenda Sétimo à legislação Directiva Cosméticos e REACH EU EU, são necessários que não envolvam animais métodos alternativos validados para avaliação confiável e precisa de toxicidade ocular no homem. Para endereçar esta necessidade, nós desenvolvemos um teste de irritação ocular (TIE), que utiliza um modelo tridimensional humana reconstruída córnea epitelial semelhante (rhce) de tecido que é baseado em células humanas normais. O IET é capaz de separar irritantes e corrosivos oculares (GHS categorias 1 e 2 combinado) e aqueles que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria). O teste utiliza dois protocolos distintos, um concebida para produtos químicos líquidos e um segundo protocolo, similar para artigos de teste sólidos. O modelo de previsão IET utiliza um único período de exposição (30 minutos para os líquidos, para 6 h de sólidos) e uma única viabilidade do tecido de corte (60,0% como determinado pelo ensaio de MTT). Com base nos resultados de 83 produtos químicos (44 líquidos e sólidos 39) IET alcançado 95,5 / 68,2 / 81,8% e sensitivity / especificidade e precisão (SS & A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / 84,6% e SS & A para sólidos, e 97,6 / 68,3 / e 83,1% para SS & A global. O EIT contribuirá significativamente para a classificação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de produtos químicos líquidos e sólidos sem a utilização de animais para atender aos requisitos regulamentares de teste. O método EpiOcular EIT foi implementada em 2015 para as Directrizes de Ensaio da OCDE como TG 492.
Produtos de consumo, como cosméticos, detergentes e produtos de limpeza domésticos incluem uma variedade de produtos químicos que podem induzir sérios danos se entrar em contato com os olhos. Portanto, o teste desses agentes para irritação dos olhos é exigido pelas agências reguladoras dos EUA e da UE para garantir a segurança dos consumidores 1. Uma avaliação do potencial de irritação ocular de misturas e formulações é também um requisito para o cumprimento REACH (Registo, Avaliação, Autorização e Restrição de Produtos Químicos) legislação para a rotulagem dos ingredientes cosméticos no âmbito da Directiva Cosméticos da UE para o transporte de produtos químicos, e para a rotulagem dos pesticidas e produtos domésticos 2. Atualmente, as agências reguladoras requerem avaliação de perigo ocular usando o Sistema Globalmente Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (GHS) 3. GHS é baseada principalmente no teste de irritação ocular de Draize, o ensaio de irritação ocular mais amplamente utilizado em que substâncias estranhas e mixtures são introduzidos directamente no saco conjuntival do olho do coelho 4. Segundo a classificação GHS, GHS Categoria 1 (substâncias corrosivas oculares) refere-se a testar produtos químicos que causam lesão inicial grave para os tecidos oculares ou sérios danos aos olhos e visão que não é totalmente reversível nos 21 dias após a exposição 3,5. GHS Categoria 2 se refere a testar substâncias químicas que produzem mudanças significativas no olho que são totalmente reversível nos 21 dias de exposição. Produtos químicos de teste que não são corrosivos ou irritantes são referidos como GHS n Categoria.
Por mais de 40 anos, o teste de olho de coelho Draize tem sido criticado por sua falta de reprodutibilidade, superestimação da resposta humana, bem como a utilização de animais vivos 5-8. Estas preocupações têm incentivado muitas propostas de aperfeiçoamento, redução e substituição do ensaio in vivo 9. A necessidade de alternativas à experimentação animal validados foi reforçadapela adopção da sétima alteração à Directiva Cosméticos, que proibiu a utilização de animais na avaliação da segurança dos produtos cosméticos (em 2005) e ingredientes (em 2009) 2.
Desde 1996, o modelo de tecido córnea semelhante reconstruído tem sido amplamente utilizada na indústria cosmética para avaliar o potencial de irritação de matérias-primas, as formulações à base de surfactante, e misturas que são concebidos para serem utilizados no composto, ou nas imediações do, olho 10-13. A utilização do modelo de tecido rhce permite a aplicação tópica directa do material de teste sobre a superfície do tecido, na sua forma nativa, não diluído. Desta forma, as formulações não solúveis em água podem ser controlados sem a sua diluição com solventes. Em resposta a EURL do ECVAM (Laboratório de Referência da União Europeia Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos) pedido de um método amplamente aplicável, simples e econômica do Irritação dos olhos Test (EIT), que utiliza um single tempo de exposição e é capaz de separar substâncias irritantes oculares e corrosivos a partir de materiais que não necessitam de marcação foi desenvolvido (Figura 1) 14. Com base nos resultados de 83 produtos químicos (44 líquidos e 39 de sólidos), o IET alcançado 95,5 / 68,2 / e 81,8% de sensibilidade / especificidade e precisão (SS & A) para líquidos, 100,0 / 68,4 / e 84,6% SS & A para sólidos, e 97,6 / 68,3 / e 83,1% para SS & A global.
Em 2007, um estudo de pré-validação multi-laboratório patrocinado pela Cosmetics Europa (anteriormente Colipa), sob os auspícios do ECVAM EURL avaliada a relevância ea fiabilidade do IET, com o objetivo de trazê-lo para validação formal 15. Neste estudo, 298 ensaios independentes foram realizados em sete laboratórios independentes. Os resultados do estudo demonstraram concordância de 99,7% na previsão com baixos coeficientes de variação entre todos os laboratórios participantes 15. Como resultado, em 2010 o protocolo EIT entrou formal EURL ECVAMprograma de validação. O estudo de validação utilizados 104 produtos químicos de teste codificados, incluindo substâncias individuais e misturas químicas, para os quais os dados de referência in vivo (dados de irritação ocular de Draize) estavam disponíveis. Baseado no sucesso deste trabalho, uma diretriz projecto de ensaio da OCDE foi apresentado em 2014. Prevê-se que o IET contribuirá significativamente para a classificação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de materiais de acordo com o sistema de classificação e rotulagem GHS da ONU.
Nós apresentamos o Olho Irritação Test (Figura 1), que foi desenvolvido para o modelo de tecido EpiOcular. O IET é capaz de separar irritantes e corrosivos oculares (GHS Categorias 1 e 2 combinados) a partir de materiais que não necessitam de rotulagem (GHS nenhuma categoria) com alto grau de sensibilidade e especificidade 17. O IET, tal como apresentado aqui não discrimina entre GHS Categoria 1 de Categoria 2 produtos químicos. O EIT foi validado para a classificação e rotulagem de irritação ocular potencial de uma vasta gama de produtos químicos, incluindo cosméticos e farmacêuticos ingredientes. Em conjunto com outros testes in vitro, o IET irá servir como um substituto para o ensaio de irritação in vivo do olho de coelho.
O IET utiliza dois protocolos similares mas distintas de materiais líquidos e sólidos, os quais variam no tempo de exposição e períodos de incubação de pós-exposição (Figura 1). O endpoint utilizado na EITé a viabilidade do tecido, determinada pelo ensaio de MTT, que tenha sido previamente usado em modelos validados de tecidos epiteliais humanos 20,21. Para realizar este ensaio, não é necessário nenhum equipamento especial além de equipamentos de cultura de células padrão. Devido ao nível elevado de reprodutibilidade de tecido-a-tecido, n = 2 tecidos, em vez de o habitualmente recomendado n = 3 são utilizados. A capacidade de utilizar n = 2 tecidos é um aspecto crítico do protocolo, uma vez que permite que um operador experiente para processar simultaneamente dois tecidos, minimizando assim a variabilidade do ensaio que podem surgir devido ao diferente tratamento dos tecidos individuais 14. Além disso, usando n = 2 tecidos por artigo, o teste de irritação de 10 substâncias de teste do mesmo estado físico (sólido ou líquido), juntamente com os controlos positivos e negativos, pode ser avaliada utilizando um kit (24 tecidos).
Outros pontos-chave que garantem classificação confiável de materiais estão as especificações para o controlo positivo substance (a viabilidade do tecido ≤50.0%), reprodutibilidade entre os tecidos duplicados (diferença <20,0%), e leituras de controle negativo (> 0,8 e <2,5).
Ao realizar o teste IET, é importante para aderir ao protocolo e validado para a dosagem sugerida e enxaguamento horários (Tabelas 3 e 4), uma vez que o desvio a partir do protocolo ou alterações nos períodos de incubação pode resultar em resultado alterada. Da mesma forma, os desvios do tempo de 3 horas para MTT incubação irá resultar em leituras diferentes MTT e pode afetar o resultado do ensaio.
Ocasionalmente, um produto químico de teste pode ter propriedades ópticas ou outras que possam interferir com o ensaio de viabilidade de tecido ou a redução de MTT causa de MTT. Por exemplo, um produto químico de teste pode reduzir directamente o MTT em azul-violeta do produto de reacção, ou pode ser uma substância que absorve a luz colorida no mesmo intervalo de formazano de MTT (~ 570 nm). No entanto, esses produtos químicos de teste vai present um problema apenas, se no momento do ensaio MTT, uma quantidade suficiente do material ainda está presente no (ou absorvidas por) o tecido. Para evitar esta interferência, procedimentos de lavagem extensivos são incorporados ao protocolo de TIE. Se a lavagem não remove o TA eo TA interfere com a redução do MTT, controles adicionais devem ser usadas para detectar e corrigir para ele. Resumidamente, se houver suspeita de redução MTT direta da substância química de ensaio, 50 jul (ou 50 mg de sólidos) do produto químico em questão é incubada durante 3 horas com uma solução de MTT a trabalhar na SCC (NC, 50 mL de água deionizada estéril, deve ser executados simultaneamente). Se a solução MTT fica azul-roxa, o artigo de teste se presume ter reduzido o MTT. Neste caso, um teste de funcionamento utilizando os controlos de tecidos mortos a criodessecagem, devem ser realizadas para avaliar se a substância de ensaio é obrigatório para o tecido e que conduz a uma redução do MTT sinal falso. Se houver redução MTT apreciável no TA-exposto, controlo de tecido morto(em relação à quantidade no tecido viável não tratada), a viabilidade dos tecidos significativo do artigo de teste deve ser corrigida subtraindo a viabilidade média do controlo morto.
O IET erra no lado da segurança, como demonstrado pela baixa incidência de falsos negativos classificações 14,15,18. É importante ressaltar que nenhum dos GHS Categoria 1 produtos químicos, que são corrosivos para o olho e que representam o mais sério perigo ocular, foram classificadas como não-irritante neste ensaio 14,15,18,19. Finalmente, uma das principais vantagens do método de ensaio rhce em vitro, é a possibilidade de testar puro líquido e matérias sólidas (as quais não é possível com culturas de células, submersas bidimensionais).
O EIT contribuirá significativamente para a determinação do potencial de irritação ocular de uma vasta gama de materiais de acordo com o sistema de classificação e rotulagem GHS. A substituição dos animais para determinar otoxicidade cular tem sido uma meta da pesquisa toxicológica por muitos anos. O método de ensaio EIT concluiu um estudo de validação formal apoiado por EURL ECVAM em 2014 eo EpiOcular EIT foi implementada nas Orientações de ensaio da OCDE como a OCDE TG 492 em 2015.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. John Harbell por seu apoio e tempo científico dedicado ao projecto IET. Os autores também gostaria de agradecer a Beiersdorf AG (Alemanha), IIVS (EUA), Mary Kay Inc. (EUA), Avon Products Inc. (EUA), Procter & Gamble / Cosmital (Suíça), Pierre Fabre Laboratoire (França), Harlan Laboratories (Reino Unido), e LVMH Parfume (França) para a participação no Centro de Estudos Multi-Internacional de pré-validação e de validação do teste de irritação ocular 15.