Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Человеческий мозг содержит оценкам, 85 миллиардов нейронов и дальнейшие 85 миллиардов без нервных клеток глии в том числе 1. Для большей части последних 100 лет неврологи, ориентированных преимущественно на нейронной популяции клеток, полагая, глиальные клетки, чтобы быть немного больше, чем пассивные поддерживающих клеток, которые представили структурную поддержку для нейронов – отсюда греческого этимологии "глии 'в переводе с английского, как "клей". Однако в последнее время, становится все более очевидным, что нейронные-глиальных взаимодействий может быть гораздо более фундаментальное значение для основных аспектов нейробиологии, нейрофизиологии и генезиса и прогрессирования многих нейродегенеративных заболеваний. Мозжечка ЗК (CGCs), наиболее распространенным однородная нейронная населения в человеческом мозге, доминировать в мозжечок и составляют более 90% своих клеточных составляющих. Следовательно, эти клетки широко используются в пробирке в качестве модельной системы для тон изучению развития нейронов, функции и патологии 2-6.
Тем не менее, CGC культуры по-прежнему содержат микроглии и других глии в возможно значительных пропорциях. В результате, данные, отображающие CGC предположительно прямые нейрональные ответов на различных обработок клеток на самом деле может возникнуть – в частично или полностью – от косвенного вторичной реакции соседних глии в культуре. Для оценки этого, мы селективно элиминируют микроглии от CGC нейрональных культур с помощью L-лейцина метилового сложного эфира (LME). LME является lysomotropic агент первоначально использовались выборочно уничтожать макрофагов 7, и с тех пор используется также выборочно разрушают микроглии от нервных, астроцитов и глиальных культур смешанных 8,9,10. ЛБМ интернализуется макрофагами и микроглии, в котором он вызывает нарушение лизосом и последующее апоптоз 13,14. Макрофаги и микроглии характерно богаты лизосом, заставляя их быть particulaжелезная дорога уязвимы при воздействии лечения LME. Этот протокол обеспечивает мощный, но простой и легкий способ удостовериться вклад микроглии в экспериментах с использованием CGC и другие нейронные системы / глиальные культуры.
Наиболее важные шаги для обеспечения успешного селективное удаление микроглии от CGC и / или смешанных культур являются: 1) поддержание стерильной и здоровый CGC культуры; 2) Фильтр стерилизации LME-среде, содержащей и возвращение раствора до рН 7,4; 3) ведение нераспределенной CGC массовой инфо…
The authors have nothing to disclose.
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |