דלדול סלקטיבית של Microglia מתא תרבויות המוח הקטן גרגיר שימוש L-לאוצין התיל אסתר
Summary
Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.
Abstract
Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.
Introduction
המוח האנושי מורכב 85 מליארד נוירונים משוערים ותאים שאינם עצביים 85 מיליארדים נוספים כוללים גליה 1. לחלק הגדול יותר של 100 השנים האחרונות מדעני המוח התמקדו בעיקר באוכלוסיית התאים העצבית, תאי גליה להאמין להיות קצת יותר מאשר תאים פסיביים תמיכה שספקו תמיכה מבנית לנוירונים – ומכאן האטימולוגיה היוונית של "גליה" תורגמה לאנגלית כ "דבק". לאחרונה, עם זאת, זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי אינטראקציות עצביות-גליה עשויות להיות הרבה יותר בסיסיות להיבטים בסיסיים של נוירוביולוגיה, נוירופיזיולוגיה, והראשית וההתקדמות של מחלות ניווניות רבות. תאי המוח הקטן גרגיר (CGCs), האוכלוסייה הומוגנית העצבית הנפוצה ביותר במוח האנושי, שולטים במוח הקטן ומהווים יותר מ -90% מהבוחרים הסלולריים שלה. כתוצאה מכך, תאים אלה היו בשימוש נרחב במבחנה כמערכת מודל לtהוא חקר התפתחות עצבית, פונקציה, ופתולוגיה 2-6.
עם זאת, תרבויות CGC עדיין מכילות מיקרוגלים וגליה אחרות בפרופורציות לטעון משמעותיות. כתוצאה מכך, נתוני CGC putatively מוצגות תגובות עצביות ישירות לטיפולי תאים שונים עשויים למעשה מתעוררים – בחלקו או בסך הכל – מהתגובה המשנית העקיפה של השכן גליה בתרבות. כדי להעריך את זה, אנחנו סלקטיבי בוטלו microglial מתרבויות עצביות CGC עם הסיוע של אסתר L-לאוצין תיל (LME). LME הוא סוכן lysomotropic שימש במקור כדי להרוס באופן סלקטיבי מקרופאגים 7, ומאז משמש לרוקן גם באופן סלקטיבי מיקרוגלים מעצביים, astrocyte, ותרבויות גליה מעורבות 8,9,10. LME מופנם על ידי מקרופאגים ומיקרוגליה, שבו היא גורמת להפרעת lysosomal ואפופטוזיס לאחר מכן 13,14. המקרופאגים ומיקרוגליה הם אופייני עשירים בlysosomes, גורמים להם להיות particularly פגיע בחשיפה לטיפול LME. פרוטוקול זה מספק דרך רבת עוצמה, אך פשוטה וקלה לברר את התרומה של מיקרוגליה בניסויי ניצול CGC ומערכות אחרות עצביות / גליה תרבות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצעדים החשובים ביותר כדי להבטיח את הסילוק בררני המוצלח של מיקרוגלים מCGC ו / או תרבויות מעורבות הן: 1) שמירה על תרבות CGC סטרילי ובריאה; 2) מסנן חיטוי הבינוני LME המכיל וחוזר הפתרון לpH 7.4; 3) שמירה על תקשורת CGC נשמרת וLME המכיל תקשורת ב 37 ° C כדי למנוע הלם חום; ו 4) עובד במהיר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was support by an Aims2Cure, UK and a UCL Impact Award Ph.D. studentship to JMP and an MRC Capacity Building Ph.D. studentship in Dementia to JMP.
Materials
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ, ., Winkler, S., Pfeiffer SE, . Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
