Maatwerk microdialysesonde ontwerp
Summary
Microdialyse is een veelgebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek. Daarom commerciële sondes zijn in grote demand.In dit werk een sonde assemblage wordt in detail uitgelegd om een betrouwbare, concentrische, op maat gemaakte microdialysesonde te bouwen voor minder dan $ 10.
Abstract
Microdialyse is een veelgebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek. Daarom commerciële sondes zijn in grote vraag naar de fysiologische, farmacologische en pathologische veranderingen in de cerebrospinale vloeistof te controleren. Helaas, commerciële probes zijn duur voor onderzoeksgroepen in openbare instellingen. In dit werk, wordt een sonde montage in detail uitgelegd om een betrouwbare, concentrische, op maat gemaakte microdialysesonde te bouwen voor minder dan $ 10. De microdialyse sonde bestaat uit een polysulfon membraan met een moleculaire cut-off van 30 kDa. Probe in vitro teruggevonden stoffen met verschillend molecuulgewicht (in de orde van 100-1,600 Da) en verschillende fysicochemische eigenschappen worden vergeleken. De probe levert een in vitro herstel van ongeveer 20% voor kleine verbindingen glucose, lactaat, acetylcholine en ATP. In vitro herstel van neuropeptiden met een molecuulgewicht tussen 1,000-1,600 Da bedraagt 2-6%. Terwijl de hogere moleculaire wacht van de neuropeptiden verlaagde in vitro herstel waarden, dialyse van verbindingen in het lagere bereik (tot 500 Da) van molecuulgewicht heeft geen grote invloed op de in vitro recovery rate. De onderhavige werkwijze maakt gebruik van een dialysemembraan met andere afkapwaarde en membraanmateriaal. Daarom is deze maat probe samenstel heeft het voordeel dat voldoende flexibiliteit stoffen dialyseren in een brede molecuulgewichtsverdeling range. Hier introduceren we een microdialysesonde met een uitwisseling lengte van 2 mm, die van toepassing zijn voor microdialyse in muis en rat gebieden van de hersenen is. Echter, de afmetingen van de sonde kan gemakkelijk worden aangepast voor grotere uitwisseling lengtes voor gebruik in grotere dieren.
Introduction
Microdialyse is een veelgebruikte techniek in neurowetenschappelijk onderzoek. Gedurende de laatste 50 jaar, heeft de minimaal invasieve microdialyse techniek voortdurend verbeterd om een gevestigde methode om de lokale concentraties van kleine moleculair gewicht verbindingen controleren in de extracellulaire ruimte geworden. Bijna elke interstitiële weefselvocht onderzocht kan worden in vrij bewegende dieren.
Gaddum introduceerde de push-pull methode in 1960. Hij gemodificeerde benadering van Feldberg et al. Waarin tubocurarine werd geperfuseerd via een canule eindigt in het laterale ventrikel en het verzamelen van het effluent ook via een canule 1. Gaddum ontwikkelde de push-pull techniek waarbij een canule bestaat uit twee concentrische stalen naalden werd geïmplanteerd in verschillende hersengebieden en geperfuseerd met een oplossing toegevoegd terwijl tegelijkertijd het neurotransmitters vrijgelaten uit de neuronen rond de tip 2. Helaas, weefsel damage veroorzaakt door de canule om de tip beperkt de toepassing van deze methode. Als verdere ontwikkeling van deze werkwijze Bito en medewerkers werd een dialysezak werkwijze waarbij de verzamelde oplossing werd afgescheiden van het omringende weefsel door een dialysemembraan. Ze geïmplanteerd een dialyse sac in het onderhuidse weefsel van de hond nek. De inhoud van de dialysezak wordt eiwitvrij en kan vele weken later worden geanalyseerd ionen en aminozuren 3. De volgende ontwikkeling was de dialytrode, een primitieve microdialyse sonde werd oorspronkelijk beschreven door Delgado in 1972 4. Tenslotte Ungerstedt en collega verbeterd ontwerp van microdialysesonde zodat het kleiner en minder verplaatste weefsel 5.
Een concentrische microdialysesonde gedraagt zich op dezelfde wijze als een bloed capillaire. Het systeem constant geperfundeerd door een oplossing die de ionische samenstelling van het omringende weefselvocht terwijl het niet de van belang zijnde analyt. The dialysemembraan blootgesteld aan de externe oplossing of weefsel semi-permeabel. Het maakt passieve diffusie van stoffen in de probe langs hun concentratiegradiënt 6. De permeabiliteit is afhankelijk van vele variabelen zoals moleculaire gewicht, vorm, lading en pH van de verbinding. Ook wordt beperkt door eigenschappen van het membraanmateriaal, poriegrootte van het membraan en de stroomsnelheid 7.
Figuren 1 en 2 tonen een concentrische microdialysesonde. De perfusievloeistof komt binnen via een inlaat slang in de metalen huls, die het kwartsglas omringt. Binnen in de metalen huls, dat stroomt langs de fused silica en laat het op zijn tip. In de ruimte tussen het dialysemembraan en polytetrafluorethyleen (PTFE) -tubing (bijvoorbeeld Teflon) de perfusievloeistof stroomt dan opwaarts. Hier, diffusie van stoffen uit het weefsel voordoet die het membraan omringen. Het dialysaat verlaat de sonde via de PTFE-buis, die is aangesloten op uitlaat slang en kan worden verzameld.
De microdialyse techniek heeft een aantal voordelen ten opzichte van andere in vivo technieken. De probe vormt een fysieke barrière zodat het dialysaat bevat geen enzymen of cellen. Daarom is er geen behoefte aan zuivering van het eluaat vóór de analyse en niet enzymatische afbraak van analyten plaatsvindt. Oxidatieve afbraak kan optreden tijdens passage van analyten in de slang, maar kunnen vaak worden voorkomen door toevoeging van een antioxidans (bijvoorbeeld ascorbinezuur) aan het perfusaat. Alternatief oxidatieve beschadiging neuropeptiden bijvoorbeeld werd effectief onderdrukt door het vervangen van de uitlaat buis met een tip aan het dialysaat 8 verzamelen. Het dialysaat kan direct worden onderzocht met bijna elke vorm van analysemethode en meerdere analyten tegelijkertijd worden verzameld. Dit systeem kan worden gebruikt in wakkere dieren, en bijna alle hersenregio's kunnenonderzocht. Bovendien infusie van geneesmiddelen door de sonde mogelijk (retrodialyse). Er zijn echter ook beperkingen van de microdialyse. De ietwat lage tijdsresolutie niet real-time informatie te verstrekken met betrekking tot neurotransmitter veranderingen. Omdat het een invasieve techniek probe implantatie veroorzaakt chirurgisch trauma en anesthesie, die invloed neurotransmitter concentraties nodig tijdens deze stap 7,9,10.
De verbindingsconcentratie in het dialysaat uit slechts een kleine hoeveelheid van de feitelijke concentratie verbinding in de extracellulaire vloeistof. Voor de berekening van de onbekende concentratie van verbinding in de extracellulaire vloeistof, relatieve in vitro herstel worden berekend. Bepaling van afzonderlijke relatieve in vitro herstel voor elke probe en elke verbinding noodzakelijk alvorens de in vivo experiment. Hiervoor wordt de sonde ondergedompeld in een oplossing die hetanalyte van belang dat de perfusievloeistof is dezelfde oplossing zonder de analyt. Na de bepaling van verbindingsconcentraties in het dialysaat, deze gegevens moeten worden genoemd de concentratie in de omringende vloeistof. In vitro recovery-bepalingen uit meerdere stoffen tegelijk 9 worden uitgevoerd.
Veel neurowetenschappelijk onderzoek groepen gebruik maken van de microdialyse techniek om neurotransmitters en metabolieten in de extracellulaire ruimte van verschillende hersengebieden onderzoeken. Zo commerciële sondes zijn in grote vraag in de neurowetenschappen onderzoeksomgeving. Een groot voordeel van commercieel beschikbare probes is de hoge bedrijfszekerheid. De experimentele set-up voor commerciële sondes is goed ingeburgerd en gevalideerd voor vele bekende neurotransmitters en metabolieten. Echter, terwijl de handel verkrijgbare microdialyse apparatuur duur en minder toepassingsflexibiliteit 11, in eis werken microdialyse sonde samenstel wordt in detail kan worden aangepast aan elke applicatie en kan worden vervaardigd voor minder dan 10 $. Deze op maat gemaakte probe is een concentrische microdialysesonde getest voor onderzoeken in verschillende hersengebieden 8.
In vitro probe teruggevonden stoffen met verschillend molecuulgewicht (bereik van 100-1,600 Da) en met verschillende fysicochemische eigenschappen worden vergeleken. In vitro bepaling herstel van glucose, lactaat en acetylcholine met een molecuulgewicht lager dan 200 Da, ATP met een molecuulgewicht van ongeveer 500 Da en neuropeptiden angiotensine II, substantie P en somatostatine met een molecuulgewicht van meer dan 1000 Da is uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Figuur 3 toont een voorbeeld probe constructie. Juiste innerlijke en uiterlijke dimensies diameter hebben nauw worden waargenomen voor buis (OD 1,6 mm, ID 350 micrometer), fused silica (OD 105 micrometer; ID 40 micrometer) en dialyse membraan (OD 245 micrometer; ID 210 micrometer). Het is ook belangrijk om een ruimte tussen membraan en gesmolten siliciumdioxide (105 um) en tussen membraan en leidingen (105 pm) en houden. Indien de waarden verschillen, kan de druk in de sonde omhoog en lekkage van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.
Materials
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
- Ungerstedt, U. Microdialysis–principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1 (2009).
- Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
- Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
- Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).
