Summary
Mikrodialyse er en almindeligt anvendt teknik i neurovidenskabelig forskning. Derfor kommercielle sonder er i stor demand.In dette arbejde en sondekonstruktion er forklaret i detaljer at bygge en pålidelig, koncentriske, skræddersyet mikrodialysesonde for mindre end $ 10.
Abstract
Mikrodialyse er en almindeligt anvendt teknik i neurovidenskabelig forskning. Derfor kommercielle sonder er i stor efterspørgsel til at overvåge fysiologiske, farmakologiske og patologiske forandringer i cerebrospinalvæske. Desværre, kommercielle sonder er dyre for forskergrupper i offentlige institutioner. I dette arbejde, er en sonde forsamling forklaret i detaljer at bygge en pålidelig, koncentriske, skræddersyet mikrodialysesonde for mindre end $ 10. Den mikrodialysesonde består af en polysulfon membran med en molekylær afskæring på 30 kDa. Probe in vitro genfindelse af stoffer med forskellig molekylvægt (i intervallet 100-1,600 Da) og forskellige fysisk-kemiske egenskaber sammenlignes. Sonden giver en in vitro inddrivelse af ca. 20% for små forbindelser glukose, laktat, acetylcholin og ATP. In vitro-inddrivelser for neuropeptider med en molekylvægt mellem 1,000-1,600 Da udgør 2-6%. Medens højere molekylære wotte af de neuropeptider sænket in vitro recovery værdier, dialyse af forbindelser i det nedre område (op til 500 Da) molekylvægte ikke har større indvirkning på in vitro recovery rate. Den foreliggende fremgangsmåde muliggør udnyttelse af en dialysemembran med andre afskæringsværdi og membranmateriale. Derfor er denne skræddersyet sondekonstruktion har den fordel tilstrækkelig fleksibilitet til at dialysere stoffer i et bredt molekylvægtsområde. Her introducerer vi en mikrodialysesonde med en længde på 2 mm udveksling, der finder anvendelse for mikrodialyse i mus og rotte hjerneområder. Dog kan dimensionerne af sonden nemt tilpasses til større veksel- længder, der skal anvendes i større dyr.
Introduction
Mikrodialyse er en almindeligt anvendt teknik i neurovidenskabelig forskning. I løbet af de sidste 50 år har den minimale-invasiv mikrodialyse teknik løbende blevet forbedret til at blive en veletableret metode til at overvåge de lokale koncentrationer af små molekylvægt i det ekstracellulære rum. Næsten hver interstitiel vævsvæske kan undersøges i frit bevægelige dyr.
Gaddum introducerede push-pull teknik i 1960'erne. Han modificeret en tilgang fra Feldberg et al., Hvori tubocurarin blev perfunderet gennem en kanyle ender i den laterale ventrikel og opsamling af spildevand også via en kanyle 1. Gaddum udviklet push-pull teknik, hvor en kanyle, der består af to koncentriske stål nåle blev implanteret i særskilte hjerneområder og perfunderet ved en opløsning under samtidig fjernelse af neurotransmittere frigivet fra neuronerne omgiver spidsen 2. Desværre, væv damage forårsaget af kanylen omkring spidsen begrænset anvendelsen af denne metode. Som en yderligere fremføring af denne fremgangsmåde, Bito og medarbejdere indført en dialysepose fremgangsmåde, hvor den opsamlede opløsning blev adskilt fra det omgivende væv ved en dialysemembran. De implanterede en dialyse sac i det subkutane væv af hunde halse. Indholdet af dialyseposen er protein-fri og kunne analyseres mange uger senere for ioner og aminosyrer 3. Den næste udvikling var dialytrode, en primitiv mikrodialysesonde, som oprindeligt blev beskrevet af Delgado i 1972 4. Endelig Ungerstedt og kolleger forbedret design af mikrodialysesonde, så det var mindre og mindre forskudte væv 5.
En koncentrisk mikrodialysesonde opfører sig på samme til en blod kapillær. Systemet er konstant perfunderes af en opløsning med den ioniske sammensætning af det omgivende vævsvæske mens mangler analytten af interesse. The dialysemembran udsat for den eksterne opløsning eller væv er semipermeabel. Den tillader passiv diffusion af stoffer ind i sonden langs deres koncentrationsgradient 6. Permeabiliteten er afhængig af mange variable, såsom molekylvægt, form, ladning og pH af forbindelsen. Det er også begrænset på grund af egenskaberne af membranmaterialet porestørrelsen af membranen og strømningshastigheden 7.
Figurerne 1 og 2 viser en koncentrisk mikrodialysesonde. Perfusionsfluidet træder via et indløb slangen i metalbøsningen, som omgiver kvartsglas. Inde i metal ærme, det strømmer ned langs kvartsglas og efterlader det på sin spids. I rummet mellem dialysemembranen og polytetrafluorethylen (PTFE) -tubing (såsom Teflon) perfusionsfluidet strømmer derefter opad. Her, diffusion af stoffer fra væv indtræffer, som omgiver membranen. Dialysatet forlader sonden gennem PTFE-slange, som er forbundet til udløbsslangen og kan opsamles.
Mikrodialysen teknik har adskillige fordele i forhold til andre in vivo teknikker. Sonden udgør en fysisk barriere med det resultat, at dialysatet ikke indeholder enzymer eller celler. Derfor er der ikke behov for oprensning af eluatet før analyse, og ingen enzymatisk nedbrydning af analytter finder sted. Oxidativ nedbrydning kan forekomme under passage af analytter i slangen, men dette kan ofte forhindres ved tilsætning af en antioxidant (f.eks ascorbinsyre) til perfusatet. Alternativt oxidative skader på neuropeptider, for eksempel, var effektivt undertrykt af udløbsslangen erstatte med en spids til opsamling af dialysatet 8. Dialysatet kan undersøges direkte med næsten alle slags analysemetode og multiple analytter kan indsamles samtidigt. Dette system kan anvendes i vågne dyr, og næsten alle hjerneregioner kan væreundersøgt. Endvidere infusion af lægemidler gennem sonden er mulig (retrodialysis). Der er dog også begrænsninger af mikrodialyse teknikken. Den noget lave tidsopløsning ikke giver real-time information om neurotransmitter ændringer. Fordi det er en invasiv teknik, probe implantation forårsager kirurgisk trauma og anæstesi, hvilket kan påvirke neurotransmitter koncentrationer, der kræves i dette trin 7,9,10.
Koncentrationen af forbindelsen i dialysatet omfatter kun en lille mængde af den faktiske forbindelse koncentrationen i den ekstracellulære væske. Til beregning af den ukendte forbindelse koncentrationen i den ekstracellulære væske, relative in vitro opsving skal beregnes. Fastsættelse af individuelle forhold in vitro inddrivelser for hver probe og hver forbindelsen er nødvendig, før du starter in vivo forsøg. Til dette formål er sonden dyppes i en opløsning indeholdende detanalyt henviser perfusionsfluidet er den samme opløsning mangler analytten af interesse. Efter bestemmelse af sammensatte koncentrationer i dialysat, denne data skal henvises til deres koncentration i den omgivende væske. In vitro-bestemmelser af flere forskellige stoffer inddrivelse kan gennemføres samtidigt 9.
Mange neurovidenskab forskergrupper bruge mikrodialyse teknik til at undersøge neurotransmittere og metabolitter i det ekstracellulære rum af distinkte områder i hjernen. Således kommercielle sonder er i stor efterspørgsel i neurovidenskab forskningsmiljø. En stor fordel ved kommercielt tilgængelige prober er den høje funktionssikkerhed. Den eksperimentelle opstilling til kommercielle prober er veletableret og valideret til mange kendte neurotransmittere og metabolitter. Men mens den kommercielt tilgængelige mikrodialyse udstyr er dyrt og har mindre fleksibilitet i anvendelsen 11, ther arbejde en mikrodialysesonde samling præsenteres i detaljer, som kan tilpasses enhver applikation og kan fremstilles for mindre end $ 10. Dette skræddersyede sonde er en koncentrisk mikrodialyse testet for undersøgelser i forskellige hjerneområder 8 sonde.
In vitro sonde genfindelse af stoffer med forskellig molekylvægt (område for 100-1,600 Da) og med forskellige fysisk-kemiske egenskaber sammenlignes. In vitro bestemmelse af genfinding af glucose, lactat og acetylcholin med en molekylvægt på mindre end 200 Da, ATP med en molekylvægt omtrent 500 Da og neuropeptider angiotensin II, substans P og somatostatin med en molekylvægt over 1.000 Da udføres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Figur 3 viser et eksempel på sondekonstruktionen. Korrekte dimensioner indre og ydre diameter skal observeres nøje for slanger (OD 1,6 mm ID 350 um), smeltet silica (OD 105 um, ID 40 um) og dialyse membran (OD 245 um, ID 210 um). Det er også vigtigt at holde et mellemrum mellem membran og kvartsglas af (105 um) og mellem membranen og røret (105 um) samt. Hvis værdierne er forskellige, kan trykket i sonden stige og føre til lækage af membranen.
Her introducerer vi en m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful to G. Barka (SunChrom GmbH, Friedrichsdorf, Germany) for his support and for providing the epoxy glue. Furthermore, the authors acknowledge Fresenius Medical Care (Bad Homburg, Germany) for supplying the Capillary Haemodiafilter FXCorDiax. Funding was obtained from Goethe University of Frankfurt.
Materials
| Epoxy glue | SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Germany | ||
| Fused silica ID 40 µm OD 105 µm | Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Germany | Art. No: 6.040105 | |
| Polysulfone membrane (haemodialysis filter FX Cor Diax 600) | Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Germany | REF: F00001593 | |
| Cyanacrylate glue (Pattex® superglue plastic) | Henkel AG&Co. KGaA, Düsseldorf, Germany | ||
| TEFLON-tubing 1.6 x 0.35 mm | SunChrom® GmbH, Friedberg, Germany | Art. No: 969-195.219 | |
| Scalpel (Feather® Surgical Blade No. 10) | pfm medical ag, cologne, Germany | Art. No: 07310 | |
| Microscope | MEIJI Techno | EMZ-8TR | |
| 30 G x 11" (0.3 x 25 mm) cannula Sterican® Z | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9324500 | |
| 25 G x 11/2" (0.5 x 40 mm) cannula 100 Sterican® | B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | REF: 9186166 | |
| Fine pen (Stabilo point 88 fine 0.4) | Schwan-STABILO Schwanhäußer GmbH & Co. KG | Art. No: 88/36 | |
| Hot glue (Glue sticks ULTRA Power x 11 mm) | Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Germany | Art. No: 4007841046910 | |
| Sandpaper P60 230 x 280 | Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhöhe, Germany | Catalog Number: 2608605397 |
References
- Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
- Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
- Ungerstedt, U. Microdialysis–principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
- Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
- Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1 (2009).
- Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
- Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
- Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).
