Summary

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Published: August 13, 2015
doi:

Summary

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

Abstract

Microscopie intravitale est une méthode qui peut être utilisée pour étudier des processus différents dans les différentes régions et des vaisseaux chez les animaux vivants. Dans ce protocole, nous décrivons la microscopie intravitale de veines de mesentery. Ceci peut être réalisé en un court laps de temps avec des résultats reproductibles montrant les interactions des leucocytes-endothélial in vivo. Nous décrivons un cadre inflammatoire après LPS défi de l'endothélium. Mais dans ce modèle on peut appliquer de nombreux types différents de conditions inflammatoires, comme bactérienne, chimique ou biologique et d'enquêter sur l'administration de médicaments et de leurs effets directs sur l'animal vivant et son impact sur le recrutement des leucocytes. Ce protocole a été appliqué avec succès à un certain nombre de traitements différents de souris et de leurs effets sur la réponse inflammatoire dans les vaisseaux. Ici, nous décrivons la visualisation des leucocytes et des plaquettes par marquage par fluorescence de la rhodamine 6G avec ceux-ci. En outre, toute imagerie spécifique peut être performed en utilisant des molécules cibles marquées par fluorescence.

Introduction

Le but de ce protocole est de décrire une technique simplifiée de microscopie intravitale de veines de mesentery chez les souris vivant pour l'observation directe des interactions leucocytes-endothélial et leuco-plaquettaire dans des conditions inflammatoires.

Microscopie intravitale a été développé pour étudier les interactions leucocytes-endothélial in vivo dans des conditions inflammatoires 1,2, ce qui est non pas anodine mais importante pour comprendre le recrutement des leucocytes inflammatoires et la fonction. La méthode que nous décrivons dans ce protocole a été développé sur la base de publications publiées antérieurement. Semblable à la visualisation plaquettes incorporation dans un thrombus croissante 3 et parallèlement à ce qui a été publié plus tôt 4, une veine mésentérique extériorisé est examiné par microscopie lumière transmise. Il existe divers autres modèles de la microscopie intra-vital tels que le muscle crémaster de rats 5 ou le foie des souris et des rats 6.

Microscopie intravitale du mésentère veine a été développée et appliquée dans les études précédentes par plusieurs groupes. Nous avons utilisé cette technique pour observer des différences dans le recrutement des leucocytes entre les souris de type sauvage et le tryptophane hydroxylase1 (TPH1) – / – souris, qui sont déficientes de la sérotonine non-neuronales et comparé les résultats à des souris dont la sérotonine plaquettaire a été pharmacologiquement appauvri par à long terme inhibiteur de la demande d'un recaptage de la sérotonine fluoxétine 7. Nous avons également examiné les interactions leucocytes-endothélial après le traitement par la fluoxétine aiguë 8.

Dans ce protocole, nous nous concentrons sur la microscopie intravitale de veines de mesentery, parce que ce modèle peut être réalisé rapidement, et permet des mesures valides de interactions leucocytes-endothélial et des plaquettes-leucocytes. Cela est beaucoup plus difficile et beaucoup de temps dans la microscopie intravitale d'autres organes, tels que les os, le foie, la peau, ou le muscle crémaster. Le model décrite ici est idéale pour l'évaluation reproductible inflammatoire de l'interaction cellule-cellule avec challengeing après un stimulus inflammatoire, comme l'injection intraperitoneale de lipopolysaccharide.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la loi de protection des animaux allemand (TierSchG). Les souris ont été logées et manipulés conformément aux bonnes pratiques de l'animal tel que défini par la FELASA (www.felasa.eu/guidelines.php) et le corps de bien-être animal nationale GV-SOLAS (www.gv-solas.de/index.html). Le comité de protection des animaux de l'Université de Fribourg ainsi que les autorités locales (Regierungspräsidium Freiburg) ont approuvé tou…

Representative Results

Un aperçu de la création expérimentale décrite dans ce protocole est montré à la figure 1. Il montre une souris avec un iléon boucle extériorisée et ses navires, qui peut être observé en microscopie intravitale. La figure 2 montre certain degré d'activation chez les animaux non traités en raison de la procédure elle-même. Mais il n'y a presque pas de roulement lent ou adhésion ferme des leucocytes par rapport à des souris LPS-traités. La figure 2</stron…

Discussion

Nous décrivons ici la préparation et la performance de la microscopie intravitale de veines de mésentère des souris in vivo. Cette méthode nous donne l'occasion d'observer les interactions leucocytes-endothélial et des plaquettes-endothélial 11 directement dans l'organisme vivant.

Comme un début de réponse à l'inflammation de l'endothélium obtient activé et interagit avec les leucocytes et les plaquettes entraînant dans le laminage, l'…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).

Materials

Rhodamine 6G Sigma-Aldrich  989-38-8
Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 Sigma-Aldrich L2637 

References

  1. Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
  2. Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
  3. Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
  4. Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
  5. Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
  6. Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
  7. Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
  8. Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
  9. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
  10. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
  11. Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
  12. Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
  13. Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
  14. Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
  15. Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).

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Cite This Article
Herr, N., Mauler, M., Bode, C., Duerschmied, D. Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice. J. Vis. Exp. (102), e53077, doi:10.3791/53077 (2015).

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