Intravital mikroskopi af leukocyt-endotel og blodplade-leukocyt Interaktioner i mesenteriale Veins i mus
Summary
This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.
Abstract
Intravital mikroskopi er en metode, der kan anvendes til at undersøge forskellige processer i forskellige regioner og fartøjer i levende dyr. I denne protokol, beskriver vi intravital mikroskopi af mesenterium vener. Dette kan udføres i en kort periode med reproducerbare resultater viser leukocyt-endotel-interaktioner in vivo. Vi beskriver en inflammatorisk indstilling efter LPS-udfordring af endotel. Men i denne model kan man anvende mange forskellige typer af inflammatoriske tilstande, ligesom bakteriel, kemiske eller biologiske og undersøge administration af lægemidler og deres direkte virkninger på levende dyr og dens indvirkning på leukocytrekruttering. Denne protokol er blevet anvendt med succes på en række forskellige behandlinger af mus og deres virkninger på inflammatorisk respons i skibe. Heri beskriver vi visualisering af leukocytter og blodplader ved fluorescens mærkning disse med rhodamin 6G. Derudover kan en specifik billeddannelse være performed anvendes målrettede fluorescerende mærkede molekyler.
Introduction
Formålet med denne protokol er at beskrive en forenklet teknik intravital mikroskopi af mesenterium vener i levende mus til direkte observation af leukocyt-endotel og leukocyt-blodplade interaktioner under inflammatoriske tilstande.
Intravital mikroskopi blev udviklet til at studere leukocyt-endotel-interaktioner in vivo under inflammatoriske tilstande 1,2, hvilket ikke trivielt, men vigtige for forståelsen af inflammatoriske leukocytrekruttering og funktion. Den metode, vi beskriver i denne protokol blev udviklet baseret på tidligere offentliggjorte publikationer. Svarende til at visualisere blodplader inkorporering i en voksende blodprop 3 og parallelt med hvad der er blevet offentliggjort tidligere 4, er et eksterioriseret mesenterium vene undersøgt ved transmitteret lysmikroskopi. Der er forskellige andre modeller af intra-vital mikroskopi såsom cremaster muscle af rotter 5 eller lever af mus og rotter 6.
Intravital mikroskopi af mesenterium vene er blevet udviklet og anvendt i tidligere undersøgelser af flere grupper. Vi har anvendt denne teknik til at observere forskelle i leukocytrekruttering mellem vildtypemus og tryptophan hydroxylase1 (TPH1) – / – mus, der er deficiente ikke-neuronal serotonin og sammenlignede resultaterne til mus, hvis blodplade serotonin blev farmakologisk udtømt ved langsigtet ansøgningen en selektiv serotonin reuptake inhibitor fluoxetin 7. Vi har også undersøgt leukocyt-endotel interaktioner efter akut fluoxetin behandling 8.
I denne protokol fokuserer vi på intravital mikroskopi af mesenterium vener, fordi denne model kan udføres hurtigt, og giver mulighed for gyldige målinger af leukocyt-endotel og blodplade-leukocyt interaktioner. Dette er meget mere udfordrende og tidskrævende i intravital mikroskopi af andre organer, såsom knogle, lever, hud, eller cremaster muskel. Tilstandenl her beskrevne er ideel til reproducerbar evaluering af inflammatorisk interaktion celle-celle efter challengeing med et inflammatorisk stimulus, såsom intraperitoneal injektion af lipopolysaccharid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri beskrives forberedelsen og udførelsen af intravital mikroskopi af mesenterium vener i mus in vivo. Denne metode giver os mulighed for at observere leukocyt-endotel og blodplader-endotel interaktioner 11 direkte i den levende organisme.
Som en tidlig reaktion på betændelse endotelet bliver aktiveret, og interagerer med leukocytter og blodplader resulterer i rullende, vedhæftning og transmigration 12. Men leukocytter også interagere med blodplader danne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Materials
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
