Intramikroskopi av Leukocytt-endothelial og blodplater-leukocytt Interaksjon i Mesenterial Vener i Mus
Summary
This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.
Abstract
Intravital mikroskopi er en metode som kan brukes til å undersøke ulike prosesser i forskjellige områder og fartøyer i levende dyr. I denne protokollen beskriver vi intramikroskopi av mesentery årer. Dette kan utføres i en kort periode med reproduserbare resultater viser leukocytt-endotel interaksjoner in vivo. Vi beskriver en inflammatorisk omgivelser etter LPS utfordringen endotelet. Men i denne modellen kan man bruke mange forskjellige typer av betennelsestilstander, som bakteriell, kjemiske eller biologiske og undersøke administrering av legemidler og deres direkte effekter på levende dyr og dens innvirkning på leukocytter rekruttering. Denne protokollen har vært brukt med hell til en rekke forskjellige behandlinger av mus og deres effekt på inflammatorisk reaksjon i skip. Heri beskriver vi visualisering av leukocytter og blodplater av fluorescens merking disse med rhodamine 6G. I tillegg kan en hvilken som helst spesifikk avbildning være performed bruker målrettede fluorescensmerkede molekyler.
Introduction
Hensikten med denne protokollen er å beskrive en forenklet teknikk for intravital mikroskopi av mesenteriet årer i levende mus for direkte observasjon av leukocytt-endotel og leukocytt-blodplateinteraksjoner henhold inflammatoriske tilstander.
Intravital mikroskopi ble utviklet for å studere leukocytt-endotel interaksjoner in vivo i henhold til inflammatoriske tilstander 1,2, som ikke er ubetydelig, men viktig for forståelsen av inflammatorisk leukocytt-rekruttering og funksjon. Metoden vi beskriver i denne protokollen ble utviklet basert på tidligere publiserte publikasjoner. I likhet med visualisering av blodplate inkorporering i en voksende trombe 3 og parallelt til det som er publisert tidligere 4 er et exteriorized mesenteriet vene undersøkt ved hjelp av transmittert lys-mikroskopi. Det finnes ulike andre modeller av intra-vital mikroskopi som cremaster muskel av rotter 5 eller lever av mus og rotter 6.
Intramikroskopi av mesentery vene har blitt utviklet og anvendt i tidligere studier av flere grupper. Vi har brukt denne teknikken til å observere forskjeller i leukocytt rekruttering mellom villtype mus og tryptofan hydroxylase1 (Tph1) – / – mus, som er mangel av ikke-nevronale serotonin og sammenlignet funnene til mus som plate serotonin ble farmakologisk oppbrukt av langsiktig søknad en selektiv serotonin reuptake inhibitor fluoksetin 7. Vi har også undersøkt leukocyttpopulasjoner-endothelial interaksjoner etter akutt fluoksetin behandling 8.
I denne protokollen har vi fokus på intramikroskopi av mesentery årer, fordi denne modellen kan gjennomføres raskt, og lar gyldige målinger av leukocytter-endothelial og blodplate leukocytt interaksjoner. Dette er mye mer vanskelig og tidkrevende i intravital mikroskopi av andre organer, slik som ben, lever, hud, muskel eller cremaster. Modusenl er beskrevet her er ideell for reproduserbar evaluering av inflammatorisk celle-celle-interaksjon etter challengeing den med en inflammatorisk stimulus, så som intraperitoneal injeksjon med lipopolysakkarid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heri vi beskriver forberedelsene og utførelsen av intravital mikroskopi av mesentery årer av mus in vivo. Denne metoden gir oss muligheten til å observere leukocyttpopulasjoner-endothelial og plate endothelial interaksjoner 11 direkte i levende organisme.
Som en tidlig reaksjon på betennelser endotelet blir aktivert og samhandler med leukocytter og blodplater som resulterer i et bølgende, heft og sjele 12. Men leukocytter også samhandle med blodplater dan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Materials
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
