Intravital mikroskopi av leukocyt-endotel och Platelet-leukocyter Interaktioner i Mesenterial Veins hos möss
Summary
This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.
Abstract
Intravital mikroskopi är en metod som kan användas för att undersöka olika processer i olika regioner och fartyg i levande djur. I detta protokoll, beskriver vi intravital mikroskopi av tarmkäx ådror. Detta kan utföras på en kort tid med reproducerbara resultat visar leukocyt-endoteliala interaktioner in vivo. Vi beskriver en inflammatorisk miljö efter LPS utmaningen av endotel. Men i denna modell kan man använda många olika typer av inflammatoriska tillstånd, som bakterier, kemiska eller biologiska och undersöka administrering av läkemedel och deras direkta effekter på levande djur och dess inverkan på leukocytrekrytering. Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt på ett antal olika behandlingar av möss och deras effekter på inflammatorisk respons i kärl. Häri beskriver vi visualisering av leukocyter och blodplättar genom fluorescerande märkning dessa med rodamin 6G. Dessutom kan någon specifik avbildning vara performed använda riktade fluorescerande molekyler.
Introduction
Syftet med detta protokoll är att beskriva en förenklad teknik för intravital mikroskopi av tarmkäxet vener i levande möss för direkt observation av leukocyt-endotel och leukocyter plätt interaktioner i inflammatoriska tillstånd.
Intravital mikroskopi har utvecklats för att studera leukocyt-endoteliala interaktioner in vivo enligt inflammatoriska tillstånd 1,2, vilket inte är trivialt, men viktigt för att förstå inflammatoriska leukocytrekrytering och funktion. Den metod vi beskriver i detta protokoll har utvecklats baserat på tidigare publicerade publikationer. I likhet med visualisera plätt inkorporering i en växande tromb 3 och parallellt med det som har publicerats tidigare 4, är en exterioriserad tarmkäx ven granskas av överförd ljusmikroskop. Det finns flera andra modeller av intra-vital mikroskopi såsom kremastermuskeln av råttor 5 eller levern hos mus och råtta 6.
Intravital mikroskopi av tarmkäxet ven har utvecklats och tillämpats i tidigare studier av flera grupper. Vi har använt denna teknik för att observera skillnader i leukocytrekrytering mellan vildtypsmöss och tryptofan hydroxylase1 (TPH1) – / – möss, som har brist på icke-neuronal serotonin och jämförde resultaten till möss vars plätt serotonin farmakologiskt utarmat av långvarig ansökan en selektiv serotoninåterupptagshämmare fluoxetin 7. Vi har även granskat leukocyt-endotel interaktioner efter akut behandling med fluoxetin 8.
I detta protokoll fokuserar vi på intravital mikroskopi av tarmkäxet vener, eftersom denna modell kan göras snabbt, och tillåter giltiga mätningar av leukocyt-endotel och trombocyter leukocyter interaktioner. Detta är mycket mer utmanande och tidskrävande i intravital mikroskopi av andra organ, såsom ben, lever, hud, eller kremastermuskeln. Lägetl som beskrivs här är perfekt för reproducerbar utvärdering av inflammatorisk cell-cell interaktion efter challengeing det med ett inflammatoriskt stimulus, såsom intraperitoneal injektion av lipopolysackarid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri beskriver vi förberedelser och genomförande av intravital mikroskopi av tarmkäxet vener hos möss in vivo. Denna metod ger oss möjlighet att observera leukocyt-endotel och trombocyter-endotel interaktioner 11 direkt i den levande organismen.
Som en tidig reaktion på inflammation endotelet blir aktiverad och interagerar med leukocyter och trombocyter resulterar i rullning, vidhäftning och trans 12. Men leukocyter samverkar även med blodplättar bild…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DU 1190/3-1).
Materials
| Rhodamine 6G | Sigma-Aldrich | 989-38-8 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5 | Sigma-Aldrich | L2637 |
References
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).
- Atherton, A., Born, G. V. Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls. The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).
- Duerschmied, D., et al. Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17). Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).
- Chauhan, A. K., et al. ADAMTS13: a new link between thrombosis and inflammation. The Journal of experimental medicine. 205, 2065-2074 (1084).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvascular research. 5, 384-394 (1973).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).
- Duerschmied, D., et al. Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice. Blood. 121, 1008-1015 (2013).
- Herr, N., et al. Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice. PloS one. 9, e88316 (2014).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab animal. 40, 155-160 (2011).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab animal. 37, 26-32 (2008).
- Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. Immune functions of platelets. Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure. European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).
- Sarma, J., et al. Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes. Circulation. 105, 2166-2171 (2002).
- Sumagin, R., Sarelius, I. H. TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).
