Sandwichartigen Mikroumgebungen zu nutzen Handy / Material-Interaktionen
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
Zellkultur wurde traditionell auf zweidimensionalen (2D) Substrate, wo Zellen mit Rezeptoren, die zur ventralen Biomaterialoberfläche haften geführt. Jedoch in vivo, die meisten Zellen sind vollständig von der extrazellulären Matrix (ECM) umgeben ist, was in einem dreidimensionalen (3D) Verteilung der Rezeptoren. Hiermit können die Unterschiede in der Outside-in-Signalwege und damit das Verhalten der Zelle auslösen.
Dieser Artikel zeigt, dass die Stimulation der dorsalen Rezeptoren von Zellen durch Überlagerung eines Films aus einem neuen Material (a sandwichartigen Kultur) bereits zu einer 2D-Substrat haftet löst wichtige Änderungen in Bezug auf Standard-2D-Kulturen. Außerdem verschiebt sich die gleichzeitige Anregung ventralen und dorsalen Rezeptoren Zellverhalten stärker an die in 3D-Umgebungen gefunden. Zusätzlich aufgrund der Art des Systems ist eine sandwichartige Kultur ein vielseitiges Werkzeug, das die Untersuchung der verschiedenen Parameter in Zell / Material inte ermöglichtractions zB Topographie, Steifigkeit und unterschiedlichen Proteinbeschichtungen sowohl auf der ventralen und dorsalen Seiten. Da schließlich sandwichartigen Kulturen werden auf 2D Substraten, mehrere Analyseverfahren bereits für Standard-2D-Kulturen entwickelt normalerweise verwendet werden kann, die Überwindung komplexere Verfahren für die 3D-Systemen benötigt.
Introduction
Traditionell Zellkultur wurde auf zweidimensionalen (2D) als Substrate verwendet, obwohl die meisten in vivo zelluläre Mikro eine dreidimensionale (3D) Natur. Diese unnatürliche 2D-Umgebung löst Veränderungen im Verhalten der Zelle als eine Möglichkeit der Selbstanpassung zu einer flachen Welt, die einen direkten Einfluss auf das Schicksal der Zelle 1,2. Daher Ergebnisse auf 2D-Zellkulturen erhalten werden, sind nicht immer reproduzierbar in vivo. Dies hat die Entwicklung von neuen relevanten Kultursystemen versuchen, mehrere physiologische ähnlichen Bedingungen um weitere Einblicke in jeder Dimension abhängige biologische Mechanismus 3,4 zu liefern gefördert.
Einer der Hauptunterschiede zwischen dem 2D- und dem 3D-Kultur in vivo-Umgebung ist die Verteilung der Zellen-Rezeptoren der extrazellulären Matrix (ECM) verankert ist: während auf 2D Substrate Zellen ventral haften, sind die Mehrzahl der Zellen in vivo vollständig durch das ECM umgeben so cell Adhäsion tritt durch eine 3D-Verteilung von Rezeptoren. Dies löst verschiedene Zelladhäsion Signaltransduktionswege modulieren, wodurch wichtige Prozesse wie Zellwachstum, Zelldifferenzierung und Genexpression. In den letzten Jahrzehnten wurden viele verschiedene 3D-Kultursysteme etabliert 5-8, obwohl ihre Variabilität und Komplexität behindert deren Standardisierung gemeinsam Zellkulturverfahren. Außerdem 3D-Systeme sind in der Regel nicht leicht zu handhaben und zu aktuellen experimentellen Verfahren 2D Substrate nicht ohne weiteres für die 3D-Kulturen hergestellt werden. Außerdem Literatur selten vergleicht 3D-Kulturen mit dem Äquivalent 2D Bedingung oder anderen 3D-Systemen, behindern die richtige Verständnis des Zellverhaltens in diesen Modellen.
Sobald mit den Zellen auf einem 2D Substrat die Anregung der dorsalen Rezeptoren haften – durch Überlagerung einer Schicht aus einem neuen Material (Sandwich-ähnlichen Kultur) – Zell-Antworten können gleichermaßen 3D-Umgebungen auszulösen. Die reaSohn dafür ist die gleichzeitige Aktivierung sowohl dorsalen und ventralen Rezeptoren zu haften und in der Sandwich-Umgebung verteilt (Abbildung 1) 9,10. Als Konsequenz Zellen eine wichtige Änderungen bezüglich 2D Kulturen 11,12. Auf diese Weise wird das Schicksal der Zelle bei der Montage aufgrund der Sandwichkultur bestimmt, da die Rücken Stimulation löst Veränderungen im zellulären Wege-Taste. Daher wird das Zellschicksal stark von der Zeit, wenn die sandwichartige Kultur zusammengebaut 11 bestimmt.
Aufgrund der Natur des Systems, ist eine sandwichartige Kultur ein einfaches und vielseitiges Werkzeug, das Studium der verschiedenen Parameter in Zell / Material-Wechselwirkungen wie Chemie, Topographie, Steifigkeit und Proteinbeschichtungen sowohl auf der ventralen und dorsalen Seiten ermöglicht. Dies bietet einen höheren Grad an Flexibilität im Vergleich zu anderen 3D-Systemen (Figur 2) aufgrund der unabhängigen dorsalen und ventralen Kombination verschieden variety der Oberflächenbeschaffenheit. Zudem können andere Zelllinien und verschiedene Zeiten, die sandwichartig zusammenzusetzen Kultur untersucht werden, was die breite Spektren von Möglichkeiten.
Ein Standardprotokoll des sandwichartigen Kultur wird unter Verwendung von detaillierten entweder Poly-L-Milchsäure (PLLA) elektrogesponnenen Fasern oder Folien als Rücken Substraten Deckglas als ventral Substrat und Fibronectin als Proteinbeschichtung. Sandwichartigen Kulturen wurden direkt nach Zellaussaat oder nach 3 h von 2D-Kultur zusammengebaut. Beachten Sie jedoch, dass andere Materialsysteme und Proteine eingesetzt werden könnten; ebenfalls sandwichartigen Kultur kann zu unterschiedlichen Zeitpunkten zusammengesetzt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heutzutage ist 3D-Kultur ein wichtiges Thema für die pharmazeutische und biotechnologische Industrie und Forschung in der Zellbiologie, einschließlich Krebs und Stammzellen. Als Folge mehrere 3D-Kultursysteme entwickelt worden. Leider Unterschiede zwischen den 3D-Systemen in der Regel in verschiedenen Zellverhalten führen, behindert das Verständnis der Zellschicksal. Außerdem sind die experimentellen Verfahren in der Regel nicht so einfach, wie für die 2D-Kultursysteme. Daher die Entwicklung neuer Kultursystemen v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
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