Microenvironments-شطيرة مثل لتسخير خلية / المواد التفاعلات
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
وقد تم تنفيذ زراعة الخلايا عادة من على ثنائية الأبعاد (2D) ركائز حيث تلتزم الخلايا باستخدام مستقبلات البطنية على سطح مادة بيولوجية. ولكن في الجسم الحي، فإن معظم الخلايا محاطة تماما المصفوفة خارج الخلية (ECM)، مما أدى إلى ثلاثي الأبعاد (3D) توزيع مستقبلات. وهذا قد يؤدي الاختلافات في الخارج في مسارات الإشارات، وبالتالي في سلوك الخلية.
يوضح هذا المقال أن تحفيز مستقبلات الخلايا الظهرية انضمت بالفعل إلى الركيزة 2D طريق تغطية فيلم من مادة جديدة (ثقافة مثل شطيرة) يطلق تغييرات هامة فيما يتعلق الثقافات 2D القياسية. وعلاوة على ذلك، والإثارة في وقت واحد من مستقبلات بطني وظهري التحولات سلوك الخلية أقرب إلى تلك التي وجدت في بيئات 3D. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لطبيعة النظام، ثقافة مثل شطيرة هو أداة متعددة الاستعمالات التي تسمح للدراسة معايير مختلفة في الخلية / المواد الأسواق العالمية ضغطهاractions، على سبيل المثال، والتضاريس، وصلابة والطلاء بروتين مختلفة في كلا الجانبين بطني وظهري. أخيرا، منذ تستند الثقافات مثل شطيرة على ركائز 2D، عدة إجراءات التحليل وضعت بالفعل للثقافات 2D القياسية يمكن استخدامها بشكل طبيعي، والتغلب على إجراءات أكثر تعقيدا اللازمة لأنظمة 3D.
Introduction
تقليديا، وقد تم تنفيذ خلية ثقافة الخروج على ثنائية الأبعاد (2D) ركائز، رغم أن معظم microenvironments الخلوية في الجسم الحي يكون لها ثلاثية الأبعاد (3D) الطبيعة. هذه البيئة 2D غير طبيعية تثير التغيرات في سلوك الخلية كوسيلة للتكيف الذاتي إلى عالم مسطح، مما يؤثر مباشرة مصير الخلية 1،2. وبالتالي، النتائج التي تم الحصول عليها في مزارع الخلايا 2D ليست دائما قابلة للتكرار في الجسم الحي. وقد شجع هذا على تطوير أنظمة جديدة للاستزراع ذات الصلة التي تسعى إلى تقديم مزيد من الشروط مثل الفسيولوجية للحصول على مزيد من نظرة ثاقبة أي البيولوجي 3،4 آلية تعتمد على البعد.
أحد الفروق الرئيسية بين الثقافة 2D و 3D على البيئة في الجسم الحي هو توزيع مستقبلات الخلايا ترتكز على المصفوفة خارج الخلية (ECM): بينما في 2D ركائز الخلايا على الالتصاق من الناحية البطنية، والغالبية العظمى من الخلايا في الجسم الحي محاصرون تماما من قبل ECM و وبالتالي ميحدث التصاق ليرة لبنانية من خلال توزيع 3D من المستقبلات. هذا بتشغيل مختلف مسارات التصاق الخلية إشارات وبالتالي تحوير العمليات الهامة مثل نمو الخلايا، تمايز الخلايا والتعبير الجيني. خلال العقود الماضية، تم إنشاء العديد من النظم الثقافة 3D المختلفة 5-8، على الرغم من التباين والتعقيد تعيق توحيد في الإجراءات خلية ثقافة مشتركة. وعلاوة على ذلك نظم 3D هي عادة ليست سهلة في التعامل معها والإجراءات التجريبية الحالية على ركائز 2D لا يمكن تأسيس بسهولة للثقافات 3D. بالإضافة إلى ذلك، الأدب نادرا ما يقارن الثقافات 3D مع حالة 2D تعادل أو الأنظمة الأخرى 3D، مما يعوق الفهم الصحيح للسلوك الخلية في هذه النماذج.
مرة واحدة لديها خلايا الالتزام على ركيزة 2D، وإثارة المستقبلات الظهرية – طريق تغطية فيلم من مادة جديدة (الثقافة مثل شطيرة) – يمكن أن تؤدي إلى استجابات الخلايا حد سواء بيئات 3D. الجرميةنجل وراء ذلك هو تفعيل في وقت واحد في كل من ظهري وبطني مستقبلات التمسك ونشر ضمن بيئة شطيرة (الشكل 1) 9،10. ونتيجة لذلك، والخلايا تخضع التغييرات الهامة فيما يتعلق الثقافات 2D 11،12. وبالتالي، يتم تحديد مصير الخلايا خلال التجمع بسبب ثقافة شطيرة، لأن التحفيز ظهري يحرض تغيرات في مسارات الخلوية الأساسية. لذلك، يتم تحديد حد كبير مصير الخلية الوقت الذي يتم تجميعها ثقافة مثل شطيرة 11.
نظرا لطبيعة النظام، ثقافة مثل شطيرة هو أداة بسيطة ومرنة تسمح دراسة معايير مختلفة في التفاعلات خلية / مواد مثل الكيمياء، والتضاريس، وصلابة والبروتين الطلاء في الجانبين بطني وظهري. وهذا يوفر درجة عالية من التنوع مقارنة بالأنظمة الأخرى 3D (الشكل 2) وذلك بسبب ظهري مستقل والجمع بين بطني من الخامس واسعةariety ظروف السطح. بالإضافة إلى ذلك، خطوط مختلفة من الخلايا وأوقات مختلفة لتجميع الثقافة مثل شطيرة يمكن دراستها، مما يزيد من أطياف واسعة من الاحتمالات.
وترد تفاصيل بروتوكول قياسي للثقافة مثل شطيرة أدناه باستخدام إما بولي-L-حمض اللاكتيك (PLLA) ألياف electrospun أو الأفلام بمثابة ركائز ظهري، ساترة الزجاج كما الركيزة بطني وفبرونيكتين كما البروتين الطلاء. تم تجميع الثقافات مثل شطيرة فقط بعد البذر الخلية أو بعد 3 ساعات من ثقافة 2D. ومع ذلك، لاحظ أن أنظمة المواد الأخرى والبروتينات يمكن أن تستخدم. وبالمثل ثقافة مثل شطيرة يمكن تجميعها في نقاط زمنية مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الوقت الحاضر، والثقافة 3D هو موضوع مهم لصناعة الأدوية والتكنولوجيا الحيوية، وكذلك البحث في بيولوجيا الخلايا، بما في ذلك السرطان والخلايا الجذعية. ونتيجة لذلك تم تطوير عدة أنظمة ثقافة 3D. لسوء الحظ، فإن الاختلافات بين النظم 3D يؤدي عادة في سلوك الخلية مختلفة، مما يعو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. . Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems–towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel ‘sandwich’ assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
