サンドイッチ状の微小環境は、Cell /材料の相互作用を活用します
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
細胞培養物は、伝統的に、細胞が生体材料の表面に腹受容体を使用して接着する二次元（2D）基板上で行われています。しかしながら、インビボで 、細胞のほとんどは完全に受容体の三次元（3D）分布をもたらす、細胞外マトリックス（ECM）によって囲まれています。これは、シグナル伝達経路における外、したがって細胞の挙動での違いをトリガすることができます。
この記事では、すでに新素材（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ね合わせることによって、2D基板に付着した細胞の背側の受容体を刺激すると、標準の2D文化に対する重要な変更をトリガーすることを示しています。また、腹側と背側の受容体の同時励起が近い3D環境で見られるものと細胞の挙動をシフトします。また、原因システムの性質上、サンドイッチ状の培養は、細胞/材料INTEで異なるパラメータの研究を可能にする汎用性の高いツールです。ractions、 例えば 、地形、剛性との両方の腹と背側面に異なるタンパク質コーティング。サンドイッチ様培養物を2D基板に基づいているので、最終的に、既に標準的な2D培養のために開発され、いくつかの分析手順は、3Dシステムのために必要な、より複雑な手順を克服し、正常に使用することができます。
Introduction
インビボ細胞微小環境の大部分は3次元（3D）の性質を持っているのに伝統的に、細胞培養物は、二次元（2D）基板上で行われています。この不自然な2D環境では、フラット世界に自己適応の方法として、細胞の挙動の変化をトリガし、これに直接影響を与える細胞の運命1,2。したがって、2D細胞培養に得られた結果は、 生体内で常に再現性がありません。これは、任意の次元に依存する生物学的メカニズムの3,4へのさらなる洞察を得るために、より生理的に似た条件を提供しようとしている新しい関連する培養システムの開発を奨励してきました。
2Dおよび3D培養における生体内環境との間の主な違いの1つは、細胞外マトリックス（ECM）に固定細胞受容体の分布である：2Dに細胞が腹側に付着する基質に対して、 インビボでの細胞の大部分は、完全にECMに囲まれているとこのように、CELLの接着は、受容体の三次元分布を介して行われます。これにより、細胞増殖、細胞分化および遺伝子発現のような重要なプロセスを調節する別の細胞接着シグナル伝達経路を誘発します。その変動性と複雑さは、一般的な細胞培養手順での標準化を妨げるのに、最後の十年の間に、多くの異なる三次元培養系は、5-8を確立されています。また3Dシステムは、通常、取り扱いが容易ではなく、2D基板上に現在の実験手順は、簡単に3Dの文化のために確立することはできません。さらに、文献はほとんどこれらのモデルにおける細胞の挙動の適切な理解を妨げ、同等の2D条件や他の3Dシステムと3Dの文化を比較しません。
一度2D基板上に付着した細胞を持つ、背側の受容体の励起 – 新材料（サンドイッチ状文化）のフィルムを重ねることでは – 似た3D環境の細胞応答を誘発することができます。 REAこの背後にある息子は背側と腹側の受容体付着およびサンドイッチ環境内で拡散する（ 図1）9,10の両方の同時活性化です。結果として、細胞は、2D培養物11,12に対する重要な変更を受けます。背側刺激が重要な細胞経路の変化をトリガするのでこのように、細胞の運命は、理由サンドイッチ文化の組み立て中に決定されます。したがって、細胞の運命は非常にサンドイッチ状培養11を組み立てられた時点で決定されます。
によるシステムの性質上、サンドイッチ状文化は両方腹と背側部で、このような化学、地形、剛性およびタンパク質のコーティングなどの細胞/材料の相互作用における異なるパラメータの研究を可能にする、シンプルで汎用性の高いツールです。これは、幅の広いVの独立した背と腹の組み合わせに他の3Dシステム（ 図2）に比べて汎用性の高い学位を提供しています表面状態のariety。また、サンドイッチ状培養を組み立てるために、異なる細胞株および異なる時間での可能性の広いスペクトルを増加させる、研究することができます。
サンドイッチ様培養の標準プロトコルは、タンパク質コーティングなどの腹側基板およびフィブロネクチンのような背側基板としてカバーガラスをポリ-L-乳酸（PLLA）エレクトロ繊維またはフィルムのいずれかを用いて以下に詳述します。サンドイッチ状の文化だけで、細胞播種後または2D培養3時間後に組み立てました。しかし、他の材料系およびタンパク質を使用できることに注意。同様にサンドイッチ状培養を異なる時点で組み立てることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在、3D培養は、癌および幹細胞を含む医薬品やバイオテクノロジーの業界だけでなく、細胞生物学の研究のための重要なトピックです。結果として、いくつかの3D培養系が開発されています。残念ながら、3Dシステムの違いは、通常、細胞の運命の理解を妨げ、別の細胞の挙動をもたらします。また、実験手順は、通常の2D培養システムのためのほど簡単ではありません。したがって、これ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. . Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems–towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel ‘sandwich’ assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
