Сэндвич-как микросреды, чтобы использовать Cell / Материал взаимодействий
Summary
The following protocol describes the procedure to assemble sandwich-like cultures to be used as an intermediate stage between bi-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cellular environments. The engineered systems can have applications in microscopy, biomechanics, biochemistry and cell biology assays.
Abstract
Клеточные культуры традиционно проводится на двумерная (2D) подложки, где клетки придерживаются помощью брюшной рецепторы поверхности биоматериала. Однако в естественных условиях, большинство клеток полностью окружены внеклеточного матрикса (ЕСМ), в результате трехмерного (3D) распределения рецепторов. Это может вызвать различия в за-в сигнальных путей и, таким образом, в поведении клеток.
Эта статья показывает, что стимулирование спинной рецепторы клеток уже придерживались в 2D подложки путем накладывания пленки нового материала (сэндвич-как культура) вызывает значительные изменения в отношении стандартных 2D культур. Кроме того, одновременное возбуждение брюшной и спинной рецепторов сдвигает поведение клеток ближе к найденному в 3D среде. Кроме того, из-за природы системы, сэндвич-культура, как это универсальный инструмент, который позволяет изучение различных параметров в ячейке / материала интеractions, например, топография, жесткость и различные белковые покрытия как на брюшной и спинной сторон. Наконец, так как сэндвич-как культуры на основе 2D субстратах, несколько процедур анализа уже разработаны для стандартных 2D культур можно использовать как обычно, преодолевая более сложные процедуры, необходимые для 3D систем.
Introduction
Традиционно, культуры клеток была проведена на би-мерных (2D) подложки, хотя большинство из естественных клеточных в микросреды имеют трехмерную (3D) характер. Это неестественное 2D среда вызывает изменения в поведении клеток как способ самонастройки в плоском мире, которые непосредственно влияет сотовый судьба 1,2. Следовательно, результаты, полученные на культурах клеток 2D не всегда воспроизводимы в естественных условиях. Это способствовало развитию новых соответствующих систем культивирования, стремящихся обеспечить более физиолого-как условия, чтобы получить более полное представление о любой размерности зависит от биологического механизма 3,4.
Одним из основных различий между 2D культуры и 3D в естественных условиях окружающей среды распределение клеточных рецепторов на якоре в внеклеточного матрикса (ЕСМ): в то время как на 2D субстраты клетки придерживаться снизу, большинство клеток в естественных условиях полностью окружен ECM и Таким образом, сеLL адгезия происходит через распределение 3D рецепторов. Это вызывает различные пути клеточной адгезии сигнализации, таким образом, модулирующих важные процессы, такие как рост клеток, дифференциации клеток и экспрессии генов. В течение последних десятилетий, много различных систем 3D культуры были созданы 5-8, хотя их изменчивость и сложность препятствуют их стандартизации в общих процедур клеточных культур. Кроме того 3D системы, как правило, не так легко обрабатывать, и в настоящее время экспериментальные процедуры по 2D субстратам не может быть легко установлено на 3D культур. Кроме того, литература редко сравнивает 3D культур с эквивалентным условием 2D или других 3D систем, препятствующих правильному пониманию поведения клеток в этих моделях.
После того, как имеющие клетки, прилипшие на 2D подложки, возбуждением рецепторов спинных – путем наложения пленки нового материала (сэндвич-как культура) – может вызвать клеточные ответы, так 3D сред. REAсын за это одновременное срабатывание обоих спинных и брюшных рецепторов придерживаться и распространения в окружающей среде сэндвич (рис 1) 9,10. Как следствие, клетки претерпевают существенных изменений по отношению к 2D культур 11,12. Таким образом, судьба клеток определяется во время сборки из-за сэндвич культуры, так как спинной стимуляция вызывает изменения в ключевых клеточных путей. Поэтому судьба клеток высоко определяется временем, когда сэндвич-культура, как собранном 11.
Из-за природы системы, сэндвич-как культура простой и универсальный инструмент, который позволяет изучение различных параметров в ячейки / материальных взаимодействий, таких как химия, топографии, жесткости и белковых покрытий как на брюшной и спинной сторон. Это обеспечивает более высокую степень универсальности по сравнению с другими 3D систем (рисунок 2) в связи с независимой спинной и брюшной сочетания широкого противАриети поверхностных условий. Кроме того, различные клеточные линии и различные времена, чтобы собрать бутерброд, как культура может быть изучена, увеличивая широкий спектр возможностей.
Стандартный протокол сэндвич-как культуры подробно ниже, используя либо поли-L-молочной кислоты (ПЛМК) electrospun волокна или пленки, как спинной субстратов, покровного стекла в качестве подложки брюшной и фибронектина как белка покрытием. Сэндвич-как культуры были собраны сразу после посева клеток или после 3 часов в 2D культуре. Тем не менее, обратите внимание, что могут быть использованы другие материальные системы и белки; Точно так же, как сэндвич-культура может быть собран в различные моменты времени.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящее время, 3D культура важная тема для фармацевтической и биотехнологической промышленности, а также исследования в области клеточной биологии, в том числе рака и стволовых клеток. Как следствие, были разработаны несколько 3D системы культуры. К сожалению, различия между 3D систе?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The support from ERC through HealInSynergy (306990) and the FPU program AP2009-3626 are acknowledged.
Materials
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1mL) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. . Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems–towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel ‘sandwich’ assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
