En Mapping in situ de las propiedades mecánicas de biopelículas por partículas de seguimiento Microrheology

Summary

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Abstract

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Introduction

La mayoría de las células bacterianas son capaces de emplear tanto (sésiles) Modos adjunta a la superficie de crecimiento ¹ planctónica (de vida libre) y. En el modo unido a la superficie de crecimiento, las células bacterianas secretan y encierran a sí mismos en grandes cantidades de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biopelículas. La EPS se compone principalmente de proteínas, exopolisacáridos, ADN extracelular y es esencial para la formación de biopelículas ^2. Sirve como un andamio físico por el cual las bacterias pueden utilizar para diferenciar espacialmente y protege a las bacterias de las condiciones ambientales nocivas y las respuestas del huésped. Los diferentes componentes de EPS tienen papeles distintos en la formación de biopelículas ³ y los cambios en la expresión de los componentes de EPS puede remodelar radicalmente las estructuras biofilm ^4. Componentes EPS también pueden funcionar como moléculas de señalización ^5, y estudios recientes han mostrado ciertos componentes EPS que interactúan con las células microbianas para guiar sus diff migración y biofilmerentiation ^6-8.

La investigación sobre la EPS en gran medida se ha avanzado sobre la base de los análisis morfológicos de los biofilms producidos por mutantes defectuosos en un componente específico de la EPS ^9,10. Además, el EPS se caracteriza generalmente en la escala macro (caracterización granel) ^11. Morfológica analiza sin embargo puede faltar detalle cuantitativa y caracterización mayor, que devuelve valores medios, pierde el detalle que existe dentro de la heterogeneidad de la biopelícula. En la actualidad existe una creciente tendencia a progresar a la caracterización en tiempo real de las propiedades mecánicas de la EPS en la escala micro. Este protocolo se muestra cómo microrheology partícula de seguimiento es capaz de determinar los efectos espacio-temporales de componentes de la matriz Pel y exopolisacáridos Psl en la viscoelasticidad y eficaz reticulación de Pseudomonas aeruginosa biofilms ^4.

Microrheology pasiva es una rh simple y baratoeology método que proporciona el más alto rendimiento del muestreo microrheological espacial de un material hasta la fecha ^12,13. En microrheology pasiva, esferas de sondas se colocan en la muestra y su movimiento Browniano, impulsado por energías térmicas (k _B T) es seguido por microscopía de vídeo. Varios partículas pueden ser rastreados de forma simultánea, y las coordenadas de tiempo-dependiente de las partículas siguen un camino aleatorio convencional. Por lo tanto, en promedio, las partículas se mantienen en la misma posición. Sin embargo, la desviación estándar de los desplazamientos o la media al cuadrado de desplazamiento (MSD) de las partículas, no es cero. Desde fluidos viscosos fluyen, la partícula MSD en un fluido viscoso crece linealmente a medida que pasa el tiempo. En contraste, la reticulación polimérico encuentra en viscoelástico o sustancias elásticas les ayuda a resistir el flujo, y las partículas se convierten limitada en su desplazamiento, que conduce a las mesetas de la curva de MSD (Figura 1A). Esta observación se deduce la relación MSDαt <sup> α, donde α es el exponente de difusión que se relaciona proporción de contribuciones elásticas y viscosas de la sustancia. Para partículas que se mueven en los fluidos viscosos a = 1, en ​​sustancias viscoelásticas 0 <α <1, y en sustancias elásticas α = 0. El MSD también puede ser usada para calcular la deformación por fluencia, que es la tendencia del material se deforme permanentemente sobre tiempo y calcula cómo fácilmente un diferenciales materiales.

La química tamaño, la densidad y la superficie de la partícula son críticos para la correcta aplicación de experimento microrheological y se eligen con respecto al sistema estudiado (en este caso los polímeros de la matriz del biofilm, véase la Figura 1B). En primer lugar, la partícula mide la reología de la sustancia con estructuras que son mucho más pequeño que la propia partícula. Si las estructuras de la sustancia son de escala similar a la partícula, el movimiento del partícu es perturbado por la forma y orientación de las estructuras individuales. Sin embargo, si las estructuras que rodean la partícula son mucho más pequeños, este efecto es pequeño y promedio, la presentación de un entorno homogéneo a la partícula (Figura 1B). En segundo lugar, la densidad de la partícula debe ser similar al del medio (1.05 g ml ^-1 para medios a base de agua) de tal manera que se evita la sedimentación y las fuerzas de inercia son insignificantes. La mayoría de las partículas con celosías de poliestireno cumplen los criterios anteriores. Idealmente, la partícula no interactúa con los polímeros de la matriz de la biopelícula como la interpretación reológico de MSD partícula sólo es válida si el movimiento es aleatorio, impulsada por la energía térmica y la colisión con estructuras de sustancias. Esto se puede observar mediante la comprobación de la partícula sonda tiende a obligar o rebotar en la superficie de un biofilm pre-adulto. Sin embargo, a pesar de la falta de atracción por el biofilm, las partículas deben ser capaces de ser incorporados a la matriz.Además, la heterogeneidad físico-químico de la biopelícula puede resultar en diferentes partículas siendo más adecuado como sondas en diferentes regiones del biofilm. De este modo, las partículas de diferentes tamaños y química de la superficie deben aplicarse a la biopelícula.

Como tal, la partícula MSD es capaz de proporcionar información útil sobre cómo los diferentes componentes contribuyen a la reología y la difusión de la biopelícula. Además, el uso de diferentes sondas le permite a uno para derivar información sobre la heterogeneidad espacial fisicoquímica de la biopelícula. Este método puede ser utilizado para probar el tratamiento antimicrobiano efecto sobre las propiedades mecánicas de la biopelícula, o aplicarse a las biopelículas de especies mixtas para investigar cómo las propiedades mecánicas de la biopelícula se cambian de la introducción de otra especie. Partículas TME también puede ser útil para la caracterización de la dispersión de la biopelícula. Tales estudios serían útiles en la comprensión de los biofilms, lo que podría mejorar los tratamientos biofilm unnd ingeniería de biofilms para actividades útiles.

Protocol

1. Biofilm Cultivo Preparación de Cepas bacterianas 1 día antes de la cultivación biofilm, preparar cultivos bacterianos planctónicas mediante la inoculación de 2 ml de medio de crecimiento apropiado de cultivo bacteriano congelado. Utilice medio Luria-Caldo (10 g L -1 NaCl, 10 g de extracto de L -1 levadura y 10 g L -1 triptona) para mucoide P. aeruginosa y sus PEL Δ Δ y PSL mutantes defectuosos. Incubar durante la noche a 37 ° C y …

Representative Results

Las propiedades viscoelásticas locales de la biopelícula en diferentes regiones de la biopelícula, que incluía los huecos (medianas por encima de la biopelícula), llanuras (capa plana indiferenciado de células) y microcolonias (véase etiquetas en la Figura 2A) fueron investigados. Los cambios temporales en propiedades viscoelásticas del biofilm durante la maduración de 3 días a 5 también se determinaron. El MSD de las partículas en los huecos se utilizó como control y comparable a la MSD de…

Discussion

Microrheology es una herramienta útil para las mediciones reológicas locales en sistemas heterogéneos, tales como las biopelículas microbianas. Es una técnica no destructiva, lo que permite la supervisión en tiempo real de los cambios reológicos dentro de la misma muestra biológica a través de múltiples puntos de tiempo. En este protocolo, microrheology partícula de seguimiento se aplicó a Pel y los mutantes de exopolisacáridos Psl el fin de investigar cómo afectan a la elasticidad y la reticulación efica…

Materials

Fluorspheres	Invitrogen	F-8821	1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss		Epifluorescent Microscope
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Peristaltic pump
Flow Cell Chambers	Technical University of Denmark
Bubble Trap	Technical University of Denmark
Silicone Tubing	Dow Corning		3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter
Clear polypropylene plastic connectors	Cole Parmer	06365-83	1/16 in. (1.588 mm)
Binder Clips			To clamp tubing
Coverslips	Thermo Scientific™ Nunc™		50 x 24 mm
Syringe 3 mL	Terumo
27G Needle	Terumo
2L Storage/Media Bottles	VWR®
Trolley			To hold biofilm setup