En cartographie in situ des propriétés mécaniques des biofilms par Microrhéologie de particules de suivi

Summary

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Abstract

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Introduction

La plupart des cellules bactériennes sont en mesure d'employer planctoniques (sans vie) et (sessiles) modes de ^croissance de 1 attaché de surface. Dans le mode de croissance fixé en surface, les cellules bactériennes sécrètent et se envelopper dans de grandes quantités de substances polymériques extracellulaires (EPS) à former des biofilms. Les EPS se compose principalement de protéines, de l'ADN, exopolysaccharide extracellulaire et est essentielle à la formation de biofilm ^2. Il sert d'échafaudage physique par lequel les bactéries peuvent utiliser pour différencier spatialement et protège les bactéries de conditions environnementales nuisibles et les réponses de l'hôte. Différents composants de l'EPS ont des rôles distincts dans la formation de biofilm ³ et les changements dans l'expression des composants EPS peut considérablement remodeler les structures de biofilm ^4. Composants EPS peuvent également fonctionner comme des molécules de signalisation ^5, et des études récentes ont montré certains composants EPS qui interagissent avec des cellules microbiennes pour guider leurs diff de migration et de biofilmérentiation ^6-8.

La recherche sur l'EPS a considérablement avancé, basé sur les analyses morphologiques des biofilms produites par mutants défectueux dans un composant spécifique des EPS ^9,10. En outre, l'EPS est généralement caractérisée à la macro-échelle (caractérisation vrac) ^11. Morphologique analyse ne peut cependant manquer de précision quantitative et la caractérisation vrac, qui retourne des valeurs moyennes, perd le détail qui existe au sein de l'hétérogénéité du biofilm. Il ya maintenant une tendance croissante à progresser à la caractérisation en temps réel des propriétés mécaniques des EPS à la micro-échelle. Ce protocole montre comment particule de suivi microrhéologie est capable de déterminer les effets spatio-temporelle des composants de la matrice et des exopolysaccharides Pel Psl sur la viscoélasticité et la réticulation efficace de biofilms de Pseudomonas aeruginosa ^4.

Microrhéologie passive est une rh simple et peu coûteuxméthode de eology qui fournit le plus haut débit de l'échantillonnage microrhéologiques spatiale d'un matériau à ce jour ^12,13. Dans microrhéologie passif, des sphères de sondes sont placés dans l'échantillon et leur mouvement brownien, grâce à des énergies thermiques _(k B T) est suivie par microscopie vidéo. Plusieurs particules peuvent être suivis en même temps, et les coordonnées dépendantes du temps des particules suivent une marche aléatoire classique. Par conséquent, en moyenne, les particules restent à la même position. Cependant, l'écart-type des déplacements ou le déplacement quadratique moyenne (MSD) des particules, est non nulle. Depuis fluides visqueux coulent, la particule MSD dans un fluide visqueux croît linéairement avec le temps. Par contre, la réticulation polymérique viscoélastique trouve dans ou substances élastiques aider à résister à l'écoulement, et les particules deviennent limitées dans leur déplacement, ce qui conduit à des plateaux de la courbe MSD (figure 1A). Cette observation suit la relation MSDαt <sup> α, où α est l'exposant de diffusion qui est le rapport des contributions élastiques et visqueuses de la substance liée. Pour les particules se déplaçant dans des fluides visqueux a = 1, en ​​des substances viscoélastiques 0 <α <1, et dans des matières élastiques α = 0. Le TMS peut également être utilisée pour calculer la compliance de fluage, qui est la tendance du matériau à se déformer de manière permanente sur Estimation du temps et avec quelle facilité les écarts matériels.

La chimie taille, la densité et la surface de la particule sont essentiels à l'application correcte de l'expérience microrhéologiques et sont choisis par rapport au système étudié (dans ce cas, les polymères de la matrice du biofilm, voir figure 1B). Tout d'abord, la mesure de la rhéologie des particules de la substance avec des structures qui sont beaucoup plus petites que la particule elle-même. Si les structures de la substance sont d'ampleur similaire à la particule, le mouvement de la nominaleticle est perturbé par la forme et l'orientation des structures individuelles. Toutefois, si les structures environnantes de la particule sont beaucoup plus petits, cet effet est faible et moyenne, à présenter un environnement homogène à la particule (figure 1B). D'autre part, la densité de la particule doit être similaire à la moyenne (1,05 g ml ^-1 pour les médiums à base d'eau) de manière que la sédimentation est évitée et les forces d'inertie sont négligeables. La plupart des particules avec treillis polystyrène répondent aux critères ci-dessus. Idéalement, la particule ne pas interagir avec les polymères de la matrice du biofilm que l'interprétation rhéologique de MSD de particules est valable uniquement si le mouvement est aléatoire, entraînée par l'énergie thermique et de collision avec les structures de la substance. Ceci peut être observé en vérifiant si la particule sonde tend à lier ou rebondir sur la surface d'un biofilm pré-adulte. Toutefois, malgré le manque d'attirance pour le biofilm, les particules doivent pouvoir être incorporés dans la matrice.De plus, l'hétérogénéité physico-chimique du biofilm peut se traduire par des particules différentes étant mieux adaptée en tant que sondes dans les différentes régions du biofilm. Ainsi, des particules de différentes tailles et la chimie de surface devraient être appliqués au biofilm.

En tant que tel, le MSD particule est en mesure de fournir des informations utiles sur la façon dont différents composants contribuent à la rhéologie et la propagation du biofilm. En outre, l'utilisation de différentes sondes permet d'obtenir des informations sur l'hétérogénéité spatiale physico-chimique du biofilm. Ce procédé peut être utilisé pour tester l'effet d'un traitement antimicrobien sur les propriétés mécaniques du biofilm, ou appliqué sur les biofilms d'espèces mélangées pour étudier la façon dont les propriétés mécaniques du film biologique sont modifiés à partir de l'introduction d'une autre espèce. Particules TMS peut aussi être utile pour la caractérisation de la dispersion du biofilm. Ces études seraient utiles dans notre compréhension des biofilms, potentiellement améliorer les traitements des biofilms une génie des biofilms pour des activités utiles.

Protocol

1. biofilm Culture Préparation de Souches bactériennes 1 jour avant la culture du biofilm, préparer des cultures bactériennes planctoniques par inoculation de 2 ml de milieu de croissance approprié de culture bactérienne congelé. Utilisez milieu Luria-Broth (10 g L -1 NaCl, 10 g d'extrait de levure L -1, et 10 g L -1 tryptone) pour mucoïde P. aeruginosa et ses Δ pel et Δ PSL mutants défectueux. Incuber une nuit à 37 ° C et 2…

Representative Results

Les propriétés viscoélastiques locaux du biofilm dans différentes régions du biofilm, qui comprenait les vides (moyennes au-dessus du biofilm), des plaines (couche de cellules indifférenciées plat) et microcolonies (voir les étiquettes de la figure 2A) ont été étudiés. Les changements temporels de propriétés viscoélastiques de la maturation du biofilm pendant 3 jours à 5 ont également été déterminés. La MSD des particules dans les vides a été utilisé comme témoi…

Discussion

Microrhéologie est un outil utile pour les mesures rhéologiques locales dans les systèmes hétérogènes, tels que les biofilms microbiens. Il est une technique non destructive, ce qui permet la surveillance en temps réel des changements rhéologiques sein d'un même échantillon biologique sur plusieurs points temporels. Dans ce protocole, microrhéologie de traces de particules a été appliqué à Pel et mutants exopolysaccharide Psl afin d'enquêter sur la façon dont ils affectent l'élasticité et …

Materials

Fluorspheres	Invitrogen	F-8821	1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss		Epifluorescent Microscope
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Peristaltic pump
Flow Cell Chambers	Technical University of Denmark
Bubble Trap	Technical University of Denmark
Silicone Tubing	Dow Corning		3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter
Clear polypropylene plastic connectors	Cole Parmer	06365-83	1/16 in. (1.588 mm)
Binder Clips			To clamp tubing
Coverslips	Thermo Scientific™ Nunc™		50 x 24 mm
Syringe 3 mL	Terumo
27G Needle	Terumo
2L Storage/Media Bottles	VWR®
Trolley			To hold biofilm setup