Em Situ Mapeamento das propriedades mecânicas de biofilmes por de rastreamento de partículas Microrheology

Summary

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

Abstract

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

Introduction

A maioria das células bacterianas são capazes de empregar tanto planctônicas (de vida livre) e (sésseis) modos ligado à superfície de crescimento ^1. No modo ligado à superfície de crescimento, as células bacterianas e secretar encerrar-se em grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares (EPS) para formar biofilmes. O EPS é constituído principalmente por proteínas, exopolissacarídeo, ADN extracelular e é essencial para a formação de biofilme ^2. Ele serve como um andaime física através da qual as bactérias podem ser utilizadas para diferenciar espacialmente e protege as bactérias de condições ambientais prejudiciais e as respostas do hospedeiro. Diferentes componentes de EPS têm papéis distintos na formação de biofilme ^{3 e} alterações na expressão de componentes EPS pode remodelar drasticamente estruturas biofilme ^4. Componentes EPS também pode funcionar como moléculas sinalizadoras ^5, e estudos recentes tem mostrado certos componentes EPS interagindo com células microbianas para orientar suas migração e biofilme differentiation ^6-8.

A investigação sobre o EPS tem muito avançado com base nas análises morfológicas dos biofilmes produzidos por mutantes defeituosos em um componente específico do EPS ^9,10. Além disso, o EPS é geralmente caracterizado na macro-escala (caracterização granel) ^11. Morfológica analisa no entanto pode faltar detalhe caracterização quantitativa e grandes quantidades, o que devolve valores médios, perde o detalhe de que existe dentro da heterogeneidade do biofilme. Existe agora uma tendência crescente para avançar para caracterização em tempo real das propriedades mecânicas do EPS no micro-escala. Este protocolo demonstra como partícula-tracking microrheology é capaz de determinar os efeitos espaço-temporais de componentes da matriz Pel e exopolissacarídeos Psl sobre a viscoelasticidade e eficaz de reticulação de Pseudomonas aeruginosa ⁴ biofilmes.

Microrheology passivo é um rh simples e baratoeology método que fornece a maior velocidade de amostragem microrheological espacial de um material à data ^12,13. Em microrheology passiva, esferas de sondas são colocados na amostra e o seu movimento Browniano, impulsionado por energias térmica (K) _B T é seguido por microscopia de vídeo. Diversas partículas podem ser monitoradas simultaneamente, e as coordenadas dependentes do tempo das partículas seguem um passeio aleatório convencional. Portanto, em média, as partículas permanecem na mesma posição. No entanto, o desvio padrão dos deslocamentos ou o deslocamento quadrático médio (MSD) das partículas, não é zero. Uma vez que o fluxo de fluidos viscosos, a partícula MSD num fluido viscoso cresce linearmente à medida que o tempo avança. Em contraste, a ligação cruzada polimérico encontrado em viscoelástico ou substâncias elásticas para ajudar a resistir a fluir, e as partículas tornam-se limitada no seu deslocamento, levando a planaltos na curva MSD (Figura 1A). Esta observação segue a relação MSDαt <saté> α, onde α é o expoente difusivo que está relacionada proporção de contribuições elásticas e viscosas da substância. Para as partículas que se deslocam em fluidos viscosos a = 1, em substâncias viscoelásticas 0 <α <1, e em substâncias elásticas α = 0. A MSD também pode ser utilizado para calcular a conformidade fluência, que é a tendência do material para deformar permanentemente sobre tempo e estima quão facilmente um spread materiais.

O tamanho, densidade e química da superfície da partícula são importantes para a aplicação correcta do experimento microrheological e são escolhidos com respeito ao sistema estudado (neste caso, os polímeros da matriz do biofilme, ver Figura 1B). Em primeiro lugar, a partícula mede a reologia da substância com as estruturas que são muito menores do que a própria partícula. Se as estruturas da substância são de dimensão semelhante à das partículas, o movimento do partigo é perturbado pela forma e orientação das estruturas individuais. No entanto, se as estruturas circundantes da partícula são muito menores, este efeito é pequena e média para fora, apresentando um ambiente homogéneo para a partícula (Figura 1B). Em segundo lugar, a densidade das partículas deve ser semelhante ao meio (1,05 g ml ^-1 de meios à base de água) de tal modo que a sedimentação é evitada e as forças de inércia são insignificantes. A maioria das partículas de poliestireno com treliças cumpram os critérios acima. Idealmente, a partícula não interage com os polímeros da matriz do biofilme como a interpretação reológico de partícula MSD só é válida se o movimento é aleatório, conduzido por energia térmica e de colisão com estruturas de substância. Isto pode ser observado através da verificação se a sonda de partículas tende a ligar-se ou saltar para fora da superfície de um biofilme de pré-adulto. No entanto, apesar da falta de atracção para o biofilme, as partículas devem ser capazes de ser incorporados na matriz.Além disso, a heterogeneidade físico-químicas do biofilme pode resultar em diferentes partículas sendo mais apropriados como sondas em diferentes regiões do biofilme. Assim, as partículas de diferentes tamanhos e química de superfície deve ser aplicado para o biofilme.

Como tal, a partícula MSD é capaz de fornecer informações úteis sobre como os diferentes componentes contribuem para a reologia e divulgação do biofilme. Além disso, a utilização de diferentes sondas permite a obtenção de informação sobre a heterogeneidade espacial físico-química do biofilme. Este método pode ser utilizado para testar o efeito do tratamento antimicrobiano sobre as propriedades mecânicas do biofilme, ou aplicado a biofilmes espécies mistas para investigar como as propriedades mecânicas do biofilme são alteradas de introdução de uma outra espécie. Partículas perturbações músculo-esqueléticas pode também ser útil para caracterizar a dispersão do biofilme. Tais estudos seriam úteis em nosso entendimento de biofilmes, melhorando potencialmente tratamentos biofilme umnd engenharia de biofilmes para atividades úteis.

Protocol

1. biofilme Cultivo Preparação de Estirpes Bacterianas 1 dia antes do cultivo biofilme, preparar culturas de bactérias planctónicas inoculando 2 ml de meio de crescimento adequado a partir da cultura bacteriana congelado. Use meio de Luria-Caldo (10 g L -1 de NaCl, 10 g L -1 extrato de levedura e 10 g L -1 triptona) para mucoid P. aeruginosa e as suas pel Δ e Δ psl mutantes defeituosos. Incubar durante a noite a 200 rpm agitação cond…

Representative Results

As propriedades viscoelásticas locais do biofilme em diferentes regiões do biofilme, que inclui os espaços vazios (médias acima do biofilme), planícies (camada plana de células indiferenciadas) e microcolônias (ver etiquetas na Figura 2A) foram investigados. As alterações temporais em propriedades viscoelásticas do biofilme durante a maturação dos dias 3 a 5 também foram determinadas. A MSD das partículas em espaços vazios foi usada como um controlo e comparável ao MSD de partículas em …

Discussion

Microrheology é uma ferramenta útil para medições reológicas locais em sistemas heterogêneos, como biofilmes microbianos. É uma técnica não destrutiva, o que permite o acompanhamento em tempo real das modificações reológicas dentro da mesma amostra biológica sobre vários pontos de tempo. Neste protocolo, de rastreamento de partículas microrheology foi aplicada a Pel e mutantes de exopolissacarídeo Psl a fim de investigar como eles afetam a elasticidade e reticulação eficaz da matriz do biofilme. Psl fa…

Materials

Fluorspheres	Invitrogen	F-8821	1.0 um red fluorescent (580/605) microspheres with carboxylate modification
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss		Epifluorescent Microscope
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Peristaltic pump
Flow Cell Chambers	Technical University of Denmark
Bubble Trap	Technical University of Denmark
Silicone Tubing	Dow Corning		3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter
Clear polypropylene plastic connectors	Cole Parmer	06365-83	1/16 in. (1.588 mm)
Binder Clips			To clamp tubing
Coverslips	Thermo Scientific™ Nunc™		50 x 24 mm
Syringe 3 mL	Terumo
27G Needle	Terumo
2L Storage/Media Bottles	VWR®
Trolley			To hold biofilm setup