In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.
Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.
כלי רכב המבוסס על ננו-חלקיקי משלוח הראו הבטחה גדולה עבור יישומי מיקוד תאיים, מתן מנגנון לשנות איתות תאית וביטוי גנים ספציפי. ניתן לטעון כלי רכב אלה עם סמים, חלבונים, וחומצות גרעין נועדו להשפיע תגובות הסלולר ולהשיג אפקט רצוי ברקמות יעד. סוגים רבים של nanocarriers נחקרו לתועלת טיפולית ואבחון כוללים שומנים, פולימרים, סיליקון, וחומרים מגנטיים. מערכות אלו הן אטרקטיביות בשל הפוטנציאל שלהם למשלוח סמים מקומיים, גדל ריכוז טיפולי ברקמות יעד, והפחתה של רעילות מערכתית.
חלקיקים מוצקים שומנים (SLNs) הם דוגמא למדה היטב של מערכת מסירת ננו-חלקיקים שנוצר ככלי להעברת תרופות מבטיח בשנים האחרונות. SLNs אפשר לנסח בקלות ליישומים רבים, כולל 1 חישת ביו, קוסמטיקה 2, ולאמשלוח herapeutic 3-7. השירות שלהם נובע מהעובדה שהם מורכבים כולו משומני resorbable, רעילים, וכתוצאה מכך ההתאמה ביולוגית משופרת. במהלך סינתזה, ניתן לשלב תרופות lipophilic לכלי רכב בלוטת זקיף, ובכך להגדיל את מסיסות תרופה והתאמת לממשל parenteral. כלי רכב בלוטת זקיף גם לעזור לייצב תרופות כמוסות, הפחתת השפלה ואישורם, ולמקסם את הפעולה טיפולית. כלי רכב אלה הם גם מתאימים במיוחד למשחק ארוך, הכנות שחרור מבוקר בשל היציבות שלהם ב3,4,8,9 טמפרטורת גוף. חשוב לציין, אנקפסולציה של תרופות בחלקיקי שומנים משנה את פרופילי pharmacokinetic הפנימיים של מולקולות התרופה. זה מספק יתרון פוטנציאלי על ידי המאפשר שחרור המבוקר של תרופות עם מדד טיפולי צר. שיעור השחרור של תרופות-התאגד בלוטת זקיף יכול להיות מכוון המבוסס על קצב פירוק שומנים או שיעור דיפוזיה התרופה במטריצת שומנים.
SLNs לעתים קרובות מהונדס להצטבר ברקמות יעד ספציפיות. לדוגמא, בגודל שלהם (בדרך כלל יותר מ -10 ננומטר) מגביר שייר במחזור, שבו כלי הדם הדולפים של רקמת גידול מקל בתצהיר. בנוסף, המסלול של ממשל חלקיקים הוכח לשנות biodistribution עם הפוטנציאל למקד מבנים פיסיולוגיים ספציפיים כגון בלוטות לימפה 10,11. על התצהיר ברקמות יעד, השיג אינטראקציות הסלולר מתאימות והפנמה סופית של חלקיקים הוא מאתגר בשל היכולת של קרום תא לשלוט באופן סלקטיבי את הזרימה של יונים ומולקולות לתוך ומחוץ לתא 12. כדי להקל על ספיגה תאית, ניתן לשנות nanocarriers עם ligands הספציפי כוללים פפטידים, מולקולות קטנות, ונוגדנים חד-שבטיים 13,14. מספר מנגנונים כוללים שתי חדירה פסיבית ותחבורה פעילה של חלקיקיםעל פני קרום התא תוארו בעבר 3,12,15. באופן כללי, זה כבר הוכיח כי אינטראקציות תא-ננו-חלקיקים מושפעות ממאפייני physicochemical של חלקיקים כולל גודל, צורה, תשלום פני השטח וכימיה של פני השטח, בנוסף לפרמטרי תא ספציפי כגון סוג תא או שלב מחזור תא 12.
חקירה קודמת הדגימה את הסינתזה של תת-10 SLNs ננומטר עבור יישומי זיהוי אקטואליים 16 וסמן ביולוגי 1 בשיטת טמפרטורת היפוך השלב (PIT) 17. זוהי שיטת סינתזה עדינה שבו 2 הרכב נשאר קבוע בעוד הטמפרטורה משתנה בהדרגה. ערבוב רציף של הפתרון המחומם, כפי שהוא מתקרר לתוצאות RT בnanoemulsion. תוצאות תהליך זה בסינתזה של SLNs עם גודל חלקיקים קטן יותר 1 מזה שדווחו בעבר תוך שימוש בשיטות שונות לסינתזה של השומנים נאןoparticles 17-22. הגודל בקנה מידה וכתוצאה מכך, פחות מ -20 ננומטר, מספק יתרון עבור יישומי מיקוד תאיים בשל הגדלת שטח פנים ואת הפוטנציאל לאינטראקציות סלולריות משופרות.
סכמטי של SLNs, נועד לספק צבע ניאון או טיפולי, מוצג באיור 1. SLNs מורכב (למשל, האלקאן ליניארי) מאפשר שילוב של תרכובות lipophilic (למשל, צבעים או הרפוי) וחיצוני פעילי שטח פנים שומנים (פעילי שטח לדוגמא, ליניארי nonionic) מוקף במים. במחקר זה, SLNs היו עמוס בצבע ניאון ומשמש כמודל לחקור אינטראקציות חלקיקי תאים. fibroblasts העיקרי אדם עור ותאים דנדריטים עכבר נחשפו לצבוע טעונים בלוטת זקיף לאורך זמן כדי לאפיין אינטראקציות ביחס לרעילות וספיגת חלקיקים. Assay 3 רומיד -2,5-diphenylphenyltetrazolium (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) (MTT) היה utilized כדי להקים רמות מינון מתאימות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי וcytometry זרימה היו שתי שיטות מועסקות לבחון ספיגת חלקיקים במבחנה.
איור 1. סכמטי של בלוטת הזקיף מראה את המרכיבים העיקריים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
במחקר זה, הסינתזה של SLNs ותחולתם ליישומי מיקוד תאיים נחקרו. חלקיקים ביולוגית אלה הראו הבטחה ככלי רכב משלוח עבור יישומים רבים, כולל משלוח סמים, השתקת גנים, וטכנולוגיות חיסון 25-30. SLNs קטן במיוחד היו מסונתז באמצעות תהליך קליל, ויחסי הגומלין שלהם עם תאי עור עיקריים ותא…
The authors have nothing to disclose.
Research reported in this publication was supported by The Johns Hopkins Applied Physics Laboratory’s Research and Exploratory Development Department, Office of Technology Transfer, and Stuart S. Janney Fellowship Program, in addition to the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number R21HL127355.
Nile Red (NiR) | Sigma | 19123 | BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0% |
Heneicosane | Aldrich | 286052 | 98% |
Brij O10 | Sigma | P6136 | Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether |
Water | Sigma | W3500 | Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding | Life Sciences | PN4612 | Non-Pyrogenic |
Nanotrac Ultra | Microtrac | serial number U1985IS | Instrument |
Differential Scanning Calorimeter | Mettlet-Toledo | —- | Instument |
Primary human fibroblasts | Life Technologies | C-004-5C | Neonatal (HDFn) |
Medium 106 | Life Technologies | M-106-500 | A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts. |
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit) | Life Technologies | S-003-K | All the components of complete LSGS |
MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-025-K | Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) |
Safire2 microplate reader | Tecan | —- | Instrument |
Phosphate buffered saline | Sigma | P5493 | For molecular biology |
Recombinant murine GM-CSF | R&D Systems | 415 | >97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain. |
Recombinant murine IL-4 | R&D Systems | 404 | >97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain. |