Solid lipidenanodeeltjes (SLN) voor intracellulaire targeting Toepassingen

Summary

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Abstract

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Introduction

Nanodeeltjes gebaseerde bestelauto's hebben aangetoond grote belofte voor intracellulaire targeting toepassingen, een mechanisme om specifiek te veranderen cellulaire signalering en genexpressie. Deze voertuigen kunnen worden beladen met geneesmiddelen, eiwitten en nucleïnezuren ontworpen om cellulaire reacties effect en een gewenst effect in doelweefsels bereiken. Veel soorten nanocarriers zijn onderzocht voor therapeutische en diagnostische nut waaronder lipiden, polymeren, silicium en magnetische materialen. Deze systemen zijn aantrekkelijk vanwege hun potentieel voor lokale afgifte van geneesmiddelen, verhoogde de therapeutische concentratie in doelweefsels, en vermindering van systemische toxiciteit.

Vaste lipidenanodeeltjes (SLN) zijn een goed bestudeerde voorbeeld van een nanodeeltje afgiftesysteem dat is ontstaan ​​als een veelbelovend geneesmiddel afgiftevehikel afgelopen jaren. SLN kunnen gemakkelijk worden geformuleerd voor meerdere toepassingen zoals biologische sensing ^1, cosmetica ² en therapeutic levering ^3-7. Hun nut voort uit het feit dat zij volledig bestaan ​​uit resorbeerbare, toxische lipiden, resulterend in verhoogde biocompatibiliteit. Tijdens synthese kunnen lipofiele geneesmiddelen in LIN.AFSCHR voertuigen worden ingebouwd, waardoor de oplosbaarheid en geschiktheid geneesmiddelen verhogen voor parenterale toediening. SLN voertuigen helpen ook om ingekapseld therapieën te stabiliseren, het verminderen van hun afbraak en klaring, en het maximaliseren van therapeutische werking. Deze voertuigen zijn bijzonder geschikt voor langwerkende, gereguleerde afgifte preparaten vanwege hun stabiliteit bij lichaamstemperatuur ^3,4,8,9. Belangrijk inkapseling van geneesmiddelen in lipidenanodeeltjes verandert de intrinsieke farmacokinetische profielen van de geneesmiddelmoleculen. Dit levert een potentieel voordeel doordat de gecontroleerde afgifte van geneesmiddelen met een nauwe therapeutische index. De afgiftesnelheid van SLN opgenomen geneeswijze kan worden afgestemd op basis van de lipide afbraaksnelheid of het geneesmiddel diffusiesnelheid in delipide matrix.

SLN zijn vaak ontworpen om te accumuleren op bepaalde doelweefsels. Bijvoorbeeld, de grootte (typisch groter dan 10 nm) versterkt retentie in de bloedsomloop, waar lekkende vasculatuur tumorweefsel vergemakkelijkt depositie. Bovendien heeft de wijze van toediening deeltje bleek te veranderen biologische verdeling met de potentie om specifieke fysiologische structuren te richten zoals lymfeknopen ^10,11. Bij afzetting in doelweefsels, de gepaste cellulaire interacties en eventuele internalisatie van nanodeeltjes uitdaging omdat het vermogen van celmembranen om selectief de stroom van ionen en moleculen in en uit de cel ^12. Om cellulaire opname te vergemakkelijken, is het mogelijk nanocarriers specifieke liganden zoals peptiden, kleine moleculen en monoklonale antilichamen ^13,14 wijzigen. Verscheidene mechanismen waaronder zowel passieve penetratie en actieve transport van nanodeeltjesover het celmembraan zijn eerder beschreven ^3,12,15. In het algemeen is aangetoond dat cellen nanodeeltjes interacties worden beïnvloed door de fysisch-chemische eigenschappen van de nanodeeltjes zoals grootte, vorm, oppervlaktelading en oppervlaktechemie, naast celspecifieke parameters zoals celtype of celcyclusfase ^12.

Een eerder onderzoek aangetoond dat de synthese van sub-10 nm SLN voor plaatselijk ^{16 en} biomarker detectie toepassingen ¹ met behulp van de methode ¹⁷ fase-inversie temperatuur (PIT). Dit is een zachte synthesemethode ² waarbij de samenstelling blijft constant terwijl de temperatuur geleidelijk wordt gewijzigd. Continu roeren van de verwarmde oplossing bij afkoeling tot KT leidt tot een nano-emulsie. Dit leidt tot de synthese van SLN met kleinere deeltjesgrootte ¹ dan eerder gerapporteerd met behulp van verschillende werkwijzen voor de synthese van lipiden nanoparticles ^17-22. De resulterende maat schaal kleiner dan 20 nm, een voordeel voor intracellulaire targeting toepassingen vanwege grotere oppervlak en de mogelijkheid van verhoogde cellulaire interacties.

Een schema van SLN, die een fluorescerende kleurstof of therapeutisch te leveren, wordt in figuur 1. De SLN bestaan ​​uit een lipide inrichting (bijvoorbeeld lineair alkaan) waardoor de opname van lipofiele stoffen (bijvoorbeeld kleurstoffen of therapeutica) en een oppervlakte exterior (bijvoorbeeld lineaire ionische surfactant), omgeven door water. In deze studie werden SLN beladen met een fluorescerende kleurstof en gebruikt als een model voor deeltjes-cel interacties te onderzoeken. Primaire menselijke dermale fibroblasten en muis dendritische cellen werden blootgesteld aan kleurstof-geladen SLN na verloop van tijd om interacties te karakteriseren met betrekking tot toxiciteit en deeltjes opname. A 3- (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) bepaling werd utilized om de juiste dosering niveaus vast te stellen. Fluorescentie microscopie en flowcytometrie werden twee methoden toegepast om deeltjes opname in vitro onderzocht.

Figuur 1. Schematische voorstelling van SLN tonen de belangrijkste bestanddelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Verwerking van SLN Synthese van SLN Opmerking: Gebruik de PIT methode 1,17,20 naar de sub-20 nm SLN 1 te bereiden. Gebruik aseptische techniek, Bioreagents of celkweek klasse reagentia en steriele materialen (dwz, pipetten, spatels, flesjes, enz.). Gebruik een bio kast voor de synthese van SLN (figuur 2). Combineer 0,6 mg fluorescente kleurstof (Nile Red (NIR), NiR concentratie ongeveer 0,3 mg / ml) en 0,10 g Henei…

Representative Results

De PIT methode werd gebruikt om de SLN synthetiseren en de fase-inversie temperatuur werd bepaald onder gebruikmaking van een waterbad. De monsters werden verhit langzaam en voorzichtig geroerd totdat de oplossing helder was. De faseomkering temperatuur voor de SLN gemaakt met heneicosane lipide 45 ° C. Tabel 1 vat de deeltjesgrootte, polydispersiteit, smeltpunt en latente smeltwarmte de SLN. De SLN gesynthetiseerd met de verwerkingsvoorwaarden bovenbeschreven gevolg control SLN en NiR geladen SLN met …

Discussion

In deze studie, de synthese van SLN en hun toepasbaarheid voor intracellulaire targeting aanvragen onderzocht. Deze biocompatibele nanodeeltjes hebben aangetoond belofte als levering voertuigen voor verschillende toepassingen, waaronder drug delivery, gene silencing, en vaccin technologieën ^25-30. Ultraklein SLN werden gesynthetiseerd met behulp van een gemakkelijk proces en hun interacties met primaire huidcellen en primaire immune cellen werden onderzocht. SLN werden ontworpen om inkapseling van een fluore…

Materials

Nile Red (NiR)	Sigma	19123	BioReagent, suitable for fluorescence, ≥98.0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylene (10) oleyl ether
Water	Sigma	W3500	Sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Syringe Filter 0.2 µm Supor Membrane Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Microtrac	serial number U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo	—-	Instument
Primary human fibroblasts	Life Technologies	C-004-5C	Neonatal (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	A sterile, liquid medium for the culture of human dermal fibroblasts.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	All the components of complete LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitive kit for the measurement of cell proliferation based upon the reduction of the tetrazolium salt, 3,[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)
Safire2 microplate reader	Tecan	—-	Instrument
Phosphate buffered saline	Sigma	P5493	For molecular biology
Recombinant murine GM-CSF	R&D Systems	415	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.
Recombinant murine IL-4	R&D Systems	404	>97%, by SDS-PAGE under reducing conditions and visualized by silver stain.