Framställning av mitokondrie-anrikade fraktioner för Metabolic Analys i<em> Drosophila</em

Summary

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Abstract

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions.

Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Introduction

Målet med detta förfarande är att utveckla anrikade mitokondriella fraktioner som ger tillräckligt mitokondriella metaboliter för metabolomik studier med Drosophila melanogaster. I vår erfarenhet, metabolomik analys med hjälp av hela cellutvinningsmetoder inte kan upptäcka subtila mitokondriella metabolit förändringar i Drosophila. Emellertid ökar mitokondriell fraktionering före metabolomik analys känsligheten för att identifiera mitokondriella metabolit skift.

Mitokondrier är cellulära organeller som ansvarar för 90% av den energi som cellerna behöver för normal funktion ^1. Under de senaste åren har man insett att mitokondrierna spela en mycket mer dynamisk roll i cellulär och organism funktion än bara producera adenosintrifosfat (ATP), och erkänns nu som nav för reglering av metabolisk homeostas ^2,3. Mitokondrier är resultatet av en endosymbiotisk process där distinct mikrobiella härstamningar fusione ~ 1,5 miljarder år sedan ^4. Som mitokondrier utvecklats till riktiga organeller, har gener från endosymbios ingår i den framväxande nukleära genomet. Hos djur idag cirka 1500 mitokondriella proteiner är kärnkodade medan 37 gener kvar i mtDNA, varav 13 kodar mitokondriella proteiner som är subenheter av enzymkomplex av oxidativ fosforylering ^5. Det behövs samordning mellan mitokondrier och kärn fack för att upprätthålla god mitokondriefunktion.

Med användning av metoderna som beskrivs här kunde vi upptäcka mitokondriella metaboliska förändringar i Drosophila som beror på manipulering av samordning mellan mitokondriella och nukleära genom. Vi använde en stam av Drosophila där mtDNA från sin syster arter D. simulans placerades på en enda D. melanogaster nukleär bakgrund ^6. Denna "stört" mitonucleargenotyp jämfördes med "native", eller co-utvecklat mitonuclear genotyp av D. melanogaster bär samma kämgenom med dess naturliga D. melanogaster mtDNA. D. melanogaster och D. simulans mtDNAs skiljer sig från ~ 100 aminosyror och> 500 synonyma substitutioner som påverkar mitonuclear kommunikations ^7,8. Vi genererade hela flyga extrakt och mitokondriella anrikade extrakt att studera metabolit förändringar som svar på farmakologisk stress. Här visar vi att när man använder mitokondriella anrikade fraktioner vi upptäcker uttalade förändringar i mitokondrie-metaboliter mellan infödda, co-utvecklad genotyp bär D. melanogaster mtDNAs och de sönderdelade genotyp som bär D. simulans mtDNA. Däremot metabolit förändringarna mellan dessa två genotyper är subtila med vanliga metoder som utnyttjar hela flyga extrakt. Därför denna metod som en väg för att förstå hur mtDNAs förmedlar mitokondriella förändringar isvar på olika droger.

Protocol

1. Reagens och lösningar Framställning av fluga mat och media Värmegylf ingredienser 11% socker, 2% autolyserad jäst, 5,2% majsmjöl, agar 0,79% vikt / volym i vatten i en värmeplatta inställd på 90 ° C. Rör om regelbundet tills en homogen svagt tät blandning erhålles. Förbered en slutlig volym av 550 ml flyga mat för totalt 100 injektionsflaskor med 5 ml flyga mat i varje. Ta bort från värmekällan, rör om då och då tills maten kyls ner till 80 ° C och tillsätt 0,2% teg…

Representative Results

Användning av protokollet förklarats ovan utförde vi metabolomic analys på mitokondriella anrikade fraktioner och hela djurextrakt för att testa effekten av drogen rapamycin på divergerande mtDNAs 7. Vi levererade 200 iM av rapamycin genom att lösa läkemedlet i farten mat. Flugor exponerades för rapamycin under 10 dagar. Metaboliter från hela gylfextrakt och från mitokondriella extrakt erhölls genom användning av gaskromatografi-masspektrometri (GC / MS) och …

Discussion

De mest kritiska stegen i detta protokoll är: 1) uppfödning tillräckligt flugor i rikligt med utrymme. Det är mycket viktigt att inte overpopulate demografin burar med mer än 150 flugor vardera; 2) ändra livsmedel av burarna ofta för att undvika mat konkurrens och närings stress; och 3) upprätthållande alla prover vid 4 ° C för att säkerställa integritet under isoleringen av den mitokondriella fraktionen. Det rekommenderas också att kyla isoleringsbuffert, tvättbuffert, och glasteflon Dounce homogenisato…

Materials

0.2% tegosept -methyl 4-hydroxybenzoate	VWR	AAA14289
Ethanol	Sigma-Aldrich	792799
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Sucrose	Sigma-Aldrich	S9378
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS)	Sigma-Aldrich	M1254
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	38057
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	5470
KCL	Sigma-Aldrich	P9333
Tris HCL	Sigma-Aldrich	RES3098T-B7
KH2PO4	Sigma-Aldrich	1551139
CO2 pads to anesthetize flies	Tritech Research	MINJ-DROS-FP
1 liter cage	Web Restaurant Store	999RD32
1 liter cage lid	Web Restaurant Store	999LRD
a glass-teflon dounce homogenizer	Fisher Scientific	NC9661231
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
rapamycin	LC Laboratories	R-5000
anti-porin	MitoSciences	MSA03
anti-alpha tubulin	Developmental Studies Hybridoma Bank	12G10
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
CO2 pad	Tritech Research, Inc	MINJ-DROS-FP
filter flask	enasco	SB08184M
rubber stopper	enasco	S08512M