쥐의 척수 손상의 모델로 초점 국소 빈혈을 Photothrombosis는 유도
Summary
Photothrombosis is a minimally invasive and highly reproducible procedure to induce focal ischemia in the spinal cord and serves as a model of spinal cord injury in mice.
Abstract
Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) below the site of injury. The secondary ischemia that develops following the initial mechanical insult is a serious complication of the SCI and severely impairs the function and viability of surviving neuronal and non-neuronal cells in the SC. In addition, ischemia is also responsible for the growth of lesion during chronic phase of injury and interferes with the cellular repair and healing processes. Thus there is a need to develop a spinal cord ischemia model for studying the mechanisms of ischemia-induced pathology. Focal ischemia induced by photothrombosis (PT) is a minimally invasive and very well established procedure used to investigate the pathology of ischemia-induced cell death in the brain. Here, we describe the use of PT to induce an ischemic lesion in the spinal cord of mice. Following retro-orbital sinus injection of Rose Bengal, the posterior spinal vein and other capillaries on the dorsal surface of SC were irradiated with a green light resulting in the formation of a thrombus and thus ischemia in the affected region. Results from histology and immunochemistry studies show that PT-induced ischemia caused spinal cord infarction, loss of neurons and reactive gliosis. Using this technique a highly reproducible and relatively easy model of SCI in mice can be achieved that would serve the purpose of scientific investigations into the mechanisms of ischemia induced cell death as well as the efficacy of neuroprotective drugs. This model will also allow exploration of the pathological changes that occur following SCI in live mice like axonal degeneration and regeneration, neuronal and astrocytic Ca2+ signaling using two-photon microscopy.
Introduction
외상성 척수 손상 (SCI)는 SC의 감각 및 자율 신경계 기능에 영향을 미치는 치명적인 임상 조건이다. SCI 생존 환자는 종종 크게 일상 생활과 삶 (1)의 품질에 영향을 마비 쇠약으로 남아 있습니다. 실험 SCI 모델은 SCI의 병태 생리 및 관련 신경 복구 프로세스를 이해하는 과학적인 조사에 필수적인 도구왔다. 이러한 모델은 기능 회복 겨냥한 다양한 실험 신경 중재 전임상 효능을 테스트하기 위해 사용되어왔다. 현재, 실제로 SCI 모델의 대부분은 기계적으로 혼란과 SC를 손상하는 물리적 둔기의 사용을 사용합니다. 이러한 방법은 SC 2의 타박상, 압축, 전위와 절개를 포함한다. 이 제안되었음을 차 기계적 모독 부상 SC에서의 허혈 세트의 형태로 보조 손상 후 3,4. 차 허혈의 원인은 조직의 부종 5-7으로 혈관의 폐색에 의해 때때로 광범위한 조직 변성, 실질 출혈 등이 포함됩니다. SC의 무결성이 더욱 영향 이차 손상의 결과로서, 뉴런 및 신경 교세포 심각 기능과 생존에 손상되고, 허혈성 주변부 다음 스트로크 성장 유사한 손상의 만성 단계에서 성장 경색에 이르게 아폽토시스를 거칠 8,9. 흥분 독성, 자유 라디칼을 생산하고, 염증과 같은 몇몇 메커니즘 SCI 10,11 다음 허혈성 세포사에 대한 책임이있는 것으로보고되었다. 또한, SC 허혈은 종종 환자 12, 13에서 하반신 마비로 이어질 흉 복부 대 동맥류 수리 수술의 심각한 합병증이다. 높은 임상 적 영향에도 불구하고 높은 재현성과 척수 허혈의 거의 모델은 현재 사용할 수 있습니다.
NT는 "> Photothrombosis (PT)이 기술은 높은 재현성 상당히 비 침습적이다. 뇌 14-20에서 국소 허혈의 유도를위한 일반적으로 사용되는 방법이며, 뇌 (17)의 노출 된 영역에서 정확한 초점 허혈성 병소를 생산 -21.이 장미 벵골 (RB) 16-20,22 또는 에리트로 B 등의 광활성 염료의 전신 투여에 의해 달성된다는 적절한 광원과 혈관의 지역화 조사 하였다 (23). 염료의 Photoactivation이 활성 산소의 생성을 일으키는 매끄러운 혈관 내피 세포의 무결성을 파괴하고, 혈소판이어서 용기 (24)에 의해 공급 부위에서 경색에 혈전 결과로. 혈류 폐색 혈전을 형성하는, 축적시킬. 인해가 온 제어 완화 강도와 조사 기간이 절차는 매우 균일하고 재현성 경색을 산출한다. 또한,이 방법은 infarc을 유도하기 위해 사용될 수있다허혈 효과의 공간 (예를 들면, 대 백질 회백질) 이해할 수 있도록 다양한 해부학 적 위치에서 t.현재의 연구는 마우스에 SC 허혈 쉽고 높은 재현성 모델을 개발하는 것이다. 우리는 마우스에서 SC 허혈의 모델 PT의 절차를 설명했다. 조직학 및 면역 염색 결과는 PT 효과적으로 사우스 캐롤라이나 경색, 신경 세포의 손실 및 반응성 신경교 증을 유도 할 수 있음을 보여 주었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에서는 SC 허혈의 photothrombotic 모델을 설명했다. 때문에 발전에 유전 공학이 가능 SC의 허혈성 병태 생리에 관여하는 특정 유전자의 영향을 연구하기 위해 만든 시판되는 형질 전환 마우스가 급증되고있다. 연구의 목적은 척수 허혈 재현성 마우스 모델을 개발하는 것이었다. 여기에서 우리는 생쥐에서 SCI를 유도하는 대뇌 피질의 PT 모델을 적용. 수술에게 T11 흉부 척추의 수준에…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 보건원 (National Institutes of Health) [그랜트 없음에 의해 지원되었다. R01NS069726] 원조 부여에서 미국 심장 협회 (American Heart Association) 그랜트 [그랜트 없음. 13GRNT17020004] SD에.
Materials
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich | 330000 | 20 mg/ml in sterile saline |
| C57Bl6/J | Jackson lab | 664 | 22-25g |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/ml |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 100 mg/ml |
| Betadine solution | Purdue | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline | Abott Laboratories | 04930-04-10 | For diluting RB, anaesthesia and for preventing tissue from drying |
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Ethanol | Decon labs.Inc | 2716 | 70% ethanol for disinfection |
| Metal halide lamp | EXFO, Canada | X-Cite 120 PC | Set power at 12% |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Standard scalpel | Fine Science Tool | 10003-12 | for removing muscle |
| Scalpel blade | Feather | 2976 | No. 10 |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Tissue adhesive glue | 3M Vetbond | 1469SB | to adhere to edges of the cut skin |
| Monofilament polypropylene | USSC Sutures | VP-521 | Size = 4-0 (for fascia) |
| Perma-hand silk | Ethicon | 683G | Size = 4-0 (for skin) |
| Micro drill | Roboz Surgical Instrument Co. Inc. | RS-6300 | with bone polishing drill bit |
| Laser doppler flowmeter | Moor Instruments | moorVMS-LDF1 | for monitoring change in blood flow |
| Heating pad | Fine Science Tool | 21052-00 | to prevent hypothermia |
| Lab-Jack | Fisher scientific | 14-673-50 | 4×4 in plate to adjust the height of the animal |
| X-Y gliding stage | Amscope | GT100 | for positioning the animal under microscope |
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