Único Detecção de Moléculas livre-Label Usando Microtoroid ópticos Resonators

Summary

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Abstract

Detecção de pequenas concentrações de moléculas até o único limite molécula tem impacto sobre áreas como a detecção precoce da doença, e estudos fundamentais sobre o comportamento das moléculas. Técnicas de detecção de moléculas individuais comumente utilizam rótulos como marcadores fluorescentes ou pontos quânticos, no entanto, os rótulos não são sempre disponível, aumentar o custo ea complexidade, e pode perturbar os eventos que estão sendo estudados. Ressoadores ópticos têm emergido como um meio promissor para detectar moléculas individuais, sem o uso de etiquetas. Atualmente, a menor partícula detectada por um sistema ressonador não plasmonically-reforçada nua óptica em solução é uma esfera de poliestireno de 25 nm ^1. Nós desenvolvemos uma técnica conhecida como Bloqueio de frequência óptica Whispering Evanescent ressonador (FLOR), que pode ultrapassar esse limite e conseguir única molécula de detecção livre-label em ^solução aquosa a 2. Como a força do sinal escalas com o volume de partículas, o nosso trabalho representa um> 100x improvement na relação sinal-ruído (SNR) em relação ao estado actual da técnica. Aqui, os procedimentos por trás FLOR são apresentados em um esforço para aumentar o seu uso no campo.

Introduction

Experiências individuais de detecção de moléculas são úteis para reduzir a quantidade de analito usada em biossensores, para a detecção precoce da doença, e para examinar as propriedades fundamentais de moléculas ^3. Tais experiências são tipicamente realizada utilizando etiquetas, no entanto, etiquetas nem sempre são possíveis de obter, para uma proteína em particular, aumentar o custo, pode perturbar os eventos a ser estudada, e pode ser inconveniente, particularmente para tempo real no local de experiências ou ponto-de- diagnóstico cuidado.

O padrão de ouro para biosensoriamento corrente livre de marcador é ressonância de plasma de superfície ^4, no entanto os sistemas de ressonância de plasmon de superfície comercial tipicamente tem um limite inferior de detecção típico da ordem de nM. Recentemente, ressonadores ópticos emergiram como uma tecnologia promissora para livre-label única molécula biodetection ^5. Ressonadores trabalho óptico baseado nas de longo prazo (ns) confinamento da luz ^6,7. A luz é evanescentlyacoplado a estes dispositivos, normalmente através de uma fibra óptica. Quando o comprimento de onda da luz que passa através da fibra corresponde ao comprimento de onda de ressonância do ressonador, luz de forma eficiente acopla ao ressonador. Isto reflecte a luz acoplada totalmente internamente dentro da cavidade do ressonador gerando um campo evanescente na vizinhança da circunferência do ressonador. Medida que as partículas entram no campo evanescente e ligam-se ao ressoador, o comprimento de onda de ressonância do ressonador as alterações na proporção do volume da partícula ^8.

Em termos de capacidade de detecção, ressoadores de microsferas têm sido anteriormente utilizados para detectar a gripe A única partículas de vírus (100 nm) ^9,10. Recentemente, plasmonically-reforçada de microsferas ressonadores ópticas têm sido utilizadas para detectar soro bovino único moléculas de albumina e ¹¹ oligonucleótidos 8-meros ^12, no entanto, esta abordagem limita a área de captura da partícula de 0,3 um por de ²vício. Biossensores maiores da área de captura são ideais para maximizar a chance de detecção de partículas. Biosensoriamento tecnologias atuais baseados na solução livre de rótulo com grandes áreas de captura (> 100 mm ²⁾ limitaram-se a detecção de partículas de poliestireno ≥ 25 nm.

Nós desenvolvemos um sistema biosensoriamento livre de marcador com base na tecnologia ressonador óptico conhecido como a frequência de travamento óptica Sussurrar Evanescentes ressonador (FLOR) ¹³ (Figura 1) que é capaz de detecção resolvida no tempo de moléculas individuais em solução. FLOR usa o tempo de vida do fóton longo dos ressonadores óticos microtoroid combinados com frequência de bloqueio de controle de feedback, detecção equilibrada, e filtragem computacional para detectar as pequenas partículas para baixo para moléculas de proteínas individuais. A utilização de frequência de bloqueio permite que o sistema sempre controlar o deslocamento de ressonância do microtoroid como partículas ligar, sem a necessidade de varrer ou digitalizar o comprimento de onda do laser sobregrandes intervalos. Os princípios da FLOR pode ser usado para melhorar as capacidades de detecção de outras técnicas, incluindo aprimoramento plasmonic. No que se segue, os procedimentos para a realização de FLOR são descritos.

Protocol

1. Setup Experimental e Preparação de Amostras Fabricar microtoroids usando a litografia, gravura, e procedimento de fusão como descrito anteriormente 6. Fabricar microtoroids no topo de uma pastilha de silício (chip) que tipicamente têm um diâmetro maior de 80-100 um, e um diâmetro menor de 2 um. Descontraia-se cerca de um metro de fibra óptica monomodo (125 revestimento mm, 4,3 mm de diâmetro campo mode) a partir do seu carretel fibra. No meio da porção de desenrola…

Representative Results

Eventos de ligação de partícula são claramente vistas como modificações tipo degrau no comprimento de onda de ressonância do microtoroid ao longo do tempo (Figura 2A). As alturas destas etapas são mostradas como um histograma na Figura 2B. As Figuras 2-4 mostram traços representativos da ligação de exossomos (nanovesulas), esferas de sílica 5 nm e individuais humanos interleucina-2 moléculas, respectivamente. O facto de que os eventos da et…

Discussion

Como uma partícula se liga, o comprimento de onda de ressonância (λ) do toro aumenta. Se uma partícula unbinds, o comprimento de onda de ressonância correspondentemente diminui (um evento passo-baixo). O diâmetro das partículas (d) pode ser determinada através de histogramas da amplitude de cada passo de comprimento de onda. A altura de cada degrau varia de comprimento de onda, devido às variações de tamanho de partícula do ligado e devido à localização na microtoroid onde se liga a part…

Materials

Tunable diode laser	Newport	TLB-6300
Laser controller	Newport	TLB-6300-LN
Frequency locking feedback controller	Toptica Photonics	Digilock 110
Auto-balanced photoreceiver	Newport	Model 2007
In-line polarization controller	General Photonics	PLC-003-S-90
24-bit data acquisition card	National Instruments	NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2	Pierce Biotechnology	R201520
20 nm polystyrene beads	Thermo Scientific	3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage	Physik Instrumente	P-611.3
Optical table	Newport	VH3660W-OPT
Objective lens for imaging column	Navitar Machine Vision	1-60228
Imaging column (adaptor tube)	Navitar Machine Vision	1-60228
High-Res CCD camera for imaging column	Edmund Industrial Optics	NT39244