Используя цифровой капли ПЦР для обнаружения гена BRAF V600E Мутации в формалине фиксированной в парафин Ссылка на стандарт клеточных линиях
Summary
Цель этого видео, чтобы продемонстрировать, как выполнить автоматизированное извлечение ДНК из фиксированных формалином парафиновых срезах (FFPE) эталонных стандартных клеточных линий и анализа цифровых капель ПЦР (ddPCR) для обнаружения редких мутаций в клинических условиях. Обнаружение мутаций в образцах FFPE демонстрирует клиническую полезность ddPCR в образцах FFPE.
Abstract
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Introduction
Накопление генетических мутаций в ключевых регуляторных генов изменяет нормальную клеточную программирования как клеточной пролиферации, дифференцировки и выживания, ведущие к раку 1. РАН-РАФ-МАР-киназы пути посредником клеточные ответы на сигналы роста. Онкогенный BRAF мутации могут привести мутаций водитель в гене BRAF, которая может привести к BRAF онкобелок чтобы стать гиперактивными 2. Мутации в гене BRAF также привести к гиперактивного передачи сигнала через МЕК и ERK 3, который, в свою очередь, приводит к чрезмерному росту и пролиферации клеток, независимо от фактора роста-опосредованной регуляции 4-6.
Некоторые инструменты доступны для мутаций ДНК профилирования, таких как количественных реального времени BRAF V600E мутаций в фиксированных формалином, парафин (FFPE) эталонных стандартных клеточных линий по ddPCR. ddPCR является метод ПЦР на основе количественного абсолютнойпредлагая более высокую точность по сравнению с обычной количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР) 7,8. ddPCR также обеспечивает более высокую разрешающую способность и точность для обнаружения редких мутаций в ДНК-матриц, что позволяет более информативный исследования рака и диагноз 9. Дополнительные преимущества по сравнению с обычными ddPCR кПЦР включают его повышенную чувствительность и точность при изучении низко шаблонов числа копий 10-12. При этом протокол для автоматического извлечения ДНК из опорных FFPE стандартных клеточных линий, за которыми следуют определения наличия или отсутствия BRAF V600E мутаций ddPCR продемонстрирована. Использование программного обеспечения для анализа данных и графического представления результатов также описаны. Вся процедура относительно проста и полностью зависит от количества образцов для профилирования и количества обычных машинах ПЦР и ddPCR доступной.
Ниже описаны стандартные протокол процедуры BR Ф. V600E-позитивных FFPE Ссылка на стандарт клеточные линии (HD598, HD593, HD617, HD273 и дикого типа (WT)) выполняется в полностью автоматическом приборе с помощью подготовки системы (ТПС) протокол тканей. Впоследствии, образцы изолированных ДНК анализировали на наличие BRAF V600E мутаций с использованием системы ddPCR. Целевой анализ мутации выполняется после всех образцов были профилированные и данные были загружены в программное обеспечение для анализа данных. В зависимости от количества образцов / исследуемых группах, анализ данных может потребовать от одного до нескольких часов. Экспериментальный компонент методологии требует точности в обработке ДНК иrological Пипетки и пипетки, видео Юпитер Наука Образование объясняя больше о о контексте пипетки "> пипетки в 96-луночных планшетах, в то время как анализ данных осуществляется с использованием программного обеспечения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы выделяем применимость ddPCR и изоляцию ДНК из FFPE справочных стандартных образцов клеточных линий для конкретной оценки мутаций гена. В этом исследовании, TPS автоматизированный метод выделения ДНК используется, которые могут быть легко адаптированы, автоматизированная, и может ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано R & D программы для общества Национального исследовательского фонда (ПЗФ), финансируемого Министерством науки, ИКТ и планирование будущего (грант № 2013M3C8A1075908).
Materials
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
- Vogelstein, B., et al. Genetic alterations during colorectal-tumor development. The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417, 949-954 (2002).
- Solit, D. B., et al. BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition. Nature. 439, 358-362 (2006).
- Wong, K. K. Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway. Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).
- Brose, M. S., et al. BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma. Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).
- Wang, L., et al. BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair. Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).
- Hindson, B. J., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification. Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).
- Jones, M., et al. Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, ‘definetherain’. Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).
- Strain, M. C., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PloS one. 8, e55943 (2013).
- Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR. Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).
- Bizouarn, F. Clinical applications using digital PCR. Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).
- McDermott, G. P., et al. Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR. Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).
- Milbury, C. A., et al. Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations. Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).
- Zhu, G., et al. Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer. The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).
- Fan, H., Gulley, M. L. DNA extraction from paraffin-embedded tissues. Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).
- Nadauld, L., et al. Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR. Translational medicine. 2, (2012).
