JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Zuivering van Mouse Brain Schepen

Published: November 10, 2015
doi:
10.3791/53208
, , ,
1Collège de France, Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Unité Mixte de Recherche 7241,Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2Centre Interdisciplinaire de Recherche en Biologie, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Science, Lettre Research University, 4Université Paris Descartes, Faculté de Pharmacie,Université Paris Diderot

Summary

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain’s vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Abstract

In de hersenen meeste vasculaire systeem bestaat uit een selectieve barrière, de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​de uitwisseling van moleculen en immuuncellen tussen de hersenen en het bloed regelt. Bovendien is de enorme neuronale metabolische vraag vereist van moment tot moment regulering van de bloedstroom. Met name afwijkingen van deze verordeningen zijn etiologische kenmerken van de meeste hersenen pathologieën; zoals glioblastoom, beroerte, oedeem, epilepsie, degeneratieve ziekten (ex: ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer), hersentumoren, alsook inflammatoire aandoeningen zoals multiple sclerose, meningitis en sepsis-geïnduceerde hersenendysfuncties. Dus, het begrijpen van de signalering gebeurtenissen moduleren van de cerebrovasculaire fysiologie is een grote uitdaging. Veel inzicht in de moleculaire en cellulaire eigenschappen van de verschillende celtypen die het cerebrovasculaire systeem samengesteld kan worden verkregen uit primaire cultuur of celsortering van vers gedissocieerde hersenweefsel. Echter,eigenschappen zoals mobiele polariteit, morfologie en intercellulaire verhoudingen niet gehandhaafd in dergelijke preparaten. Het protocol dat hier beschreven is ontworpen om hersenen vat fragmenten te zuiveren met behoud van structurele integriteit. We tonen aan dat geïsoleerde vaten bestaan ​​uit endotheliale cellen afgedicht door tight junctions die worden omringd door een continue basale lamina. Pericyten, blijven gladde spiercellen en de perivasculaire astrocyt eindvoetjes van astrocyten membranen de endotheellaag bevestigd. Tot slot beschrijven we hoe immunokleuring experimenten uit te voeren op gezuiverd hersenen schepen.

Introduction

De correcte werking van het centrale zenuwstelsel (CNS) is een sterk gereguleerd extracellulaire omgeving en zijn metabole eisen zijn groot in vergelijking met andere organen 1. Het CNS is ook zeer gevoelig voor een groot aantal chemicaliën, algemeen onschadelijk perifere organen maar om het, neurotoxisch. Om een ​​correcte werking te garanderen, de meeste van de CNS 'vaatstelsel vormt een endotheliale barrière; de bloed-hersenbarrière (BBB), die de stroom van moleculen en ionen en de passage van immuuncellen tussen bloed en hersenen controleert, waardoor goede homeostase 2 handhaven, maar ook beperken van de intrede van therapeutische geneesmiddelen, waardoor belemmerd behandelingen neurologische aandoeningen 3. Op cellulair niveau wordt de BBB voornamelijk ondersteund door uitgebreide tight junctions tussen endotheelcellen, gepolariseerde expressie van efflux transporters en een zeer lage prijs transcytose 4. Eigenschappen en functies van de BBB worden meestal veroorzaakt door neighboring cellen 4. Vooral pericytes een belangrijke rol spelen bij het ​​induceren en handhaven van de BBB 5,6. Omdat contractiele cellen, pericyten reguleren ook de doorbloeding 7 net als de gladde spiercellen omliggende grote schepen. Tenslotte astrocyten, grote gliale cellen van de hersenen, om grote processen eindvoetjes van astrocyten ongeveer uitgeroepen meeste hersenen vasculatuur 8 en moduleren BBB integriteit en immune rust 9, de overdracht van metabolieten neuronen 10, en induceren de nauwe koppeling tussen neuronale activiteit en bloedstroom 11,12.

De mogelijkheid om de moleculaire en cellulaire eigenschappen van het cerebrovasculaire systeem bestuderen cruciaal is om beter te karakteriseren zijn bijdrage aan de hersenen en fysiopathologie. Om deze vraag te pakken, hebben strategieën om cerebrovasculaire systeem van de hersenen te isoleren ontwikkeld, die het mogelijk maken voor de voorbereiding van de intacte fragmenten hersenen vat. Cerebrale vaartuig purification werd aanvankelijk beschreven met boviene hersenen 13 en verbeterd en aangepast aan andere diersoorten, vooral knaagdieren 14. In dit laatste onderzoek, het gebruik van filters van variërende grootte werd geïntroduceerd hersenvaten in fracties verrijkt in vaten van verschillende diameters te scheiden. Interessant is dat in dergelijke preparaten, endotheelcellen hielden hun metabolische eigenschappen 15, transporter functionaliteit 16 en 17 polarisatie. Hier beschrijven we in detail dit protocol en verder aan te tonen dat geïsoleerde schepen de meeste van hun behoud in situ constructies. Endotheelcellen blijven verbonden door krappe kruispunten en omgeven door een continue basale lamina. Pericyten en gladde spiercellen blijven de endotheliale laag, evenals perivasculaire astrocyten membranen bevestigd. Echter, astrocyten, microgliacellen, neuronen en oligodendrocyten geëlimineerd. Tenslotte beschrijven we een procedure uit te voeren immunokleuring op geïsoleerde vaten hersenen. </p>

Tot nu toe de meeste van de moleculaire en cellulaire studies over de cerebrovasculaire systeem zijn uitgevoerd op gezuiverd hersenen vat cellen gedissocieerd door-celsortering gebruik van mobiele specifieke reporter muis stammen of-immunokleuring gebaseerde procedures 18,19. Hoewel deze technieken maakt de isolatie van bijna zuiver cerebrovasculaire celpopulaties, geïsoleerde cellen volledig verliezen hun in situ morfologie en interacties, die op hun beurt sterk hun moleculaire en cellulaire eigenschappen beïnvloedt. Het protocol hier beschreven, waardoor de isolatie van hele cerebrovasculaire fragmenten zonder de noodzaak van specifieke antilichamen en transgene muizen vlekken, een goed alternatief de algemene structuur van geïsoleerde hersenvaten behouden dus vermindering weerslag op hun moleculaire eigenschappen. Geïsoleerde schepen kunnen dan worden gebruikt voor het bestuderen van de activiteit van genen, eiwitsynthese en regelgeving op de BBB zoals onlangs beschreven 20,21 </sup>. Tot slot, in vergelijking met lasermicrodissectie 22,23 het huidige protocol is goedkoop, gemakkelijk uit te voeren en snel aanpasbaar aan een laboratorium.

Protocol

1. Oplossingen en Materialen Bereid oplossingen isolatie vaartuig: B1, voeg 1,5 ml HEPES 1M tot 150 ml van HBSS; B2, voeg 3,6 g dextran 20 ml B1; B3, voeg 1 g BSA tot 100 ml B1. Wijzig de filterhouder door het snijden van de onderkant van de bovenste deel schroeven. Bereid immunokleuring oplossingen: Fixatie oplossing 4% paraformaldehyde in PBS pH 7,4; Permeabilisatie / blokkeeroplossing verdund geit serum tot 5% Triton X100 en 0,25% in PBS pH 7,4. Opmerking: Fixatie afhankelijk van…

Representative Results

Hier, een protocol waardoor de mechanische isolatie van de hersenen schepen 14 beschrijven we. Figuur 1 geeft een overzicht van de belangrijkste stappen van deze techniek. De architectuur van de hersenvaten is ingewikkeld en omvat verschillende celtypes, dwz endotheelcellen verzegeld door tight junctions omgeven door pericyten, gladde spiercellen, en astrocyten voet 9 processen. Aldus, na isolering van de hersenvliezen, wilden wij de structuur van gezuiverde vaartuigen kar…

Discussion

De bloed-hersenbarrière regelt de doorgang van fysiologische stoffen in en uit het CZS en beschermt tegen potentieel schadelijke stoffen in het bloed. Het is betrokken bij diverse CNS ziekten, waaronder neurodegeneratieve ziekten 2 en hersentumoren 28. De extreem lage permeabiliteit van de BBB belemmert ook de doorgang van therapeutische middelen gericht op neurale cellen en de ontwikkeling van methoden voornemens reversibel openen BBB zonder nadelige gevolgen voor de hersenen is een zeer actief o…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de Labex MemoLife en door de ARSEP (Fondation pour l'aide à la recherche sur la sclerose en plaques)

Materials

Tissue Grinder Size C Thomas scientific 3431E25
centrifuge 5415 R Eppendorf
centrifuge 5810 R Eppendorf 5811000320
High-performance, Modular Stereomicroscope Leica MZ6
Compact System Provides High Quality Leica LED1000 Leica LED1000
low binding tips (P1000) Sorenson BioScience 14200T
Swinnex 47mm filter holder PP 8/Pk Millipore SX0004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 20µm 47mm 100/Pk Millipore NY2004700
Nylon net filter disc Hydrophilic 100µm 47mm 100/Pk Millipore NY1H04700
Standard Wall Borosilicate Tubing Sutter Instrument B150-86-7.5
Microscope Slides Thermo Scientific 1014356290F
Cover Slips, Thickness 1 Thermo Scientific P10143263NR1
0,2 ml Thin-walled tubes and domed cap Thermo Scientific AB-0266
 PARAFILM® M (roll size 4 in. × 125 ft) Sigma P7793-1EA
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Life technology 14175-129
HEPES (1M) Life technology 15630056
Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000 Sigma 31390
Bovine serum albumin Sigma A2153
PBS 10X Euromedex ET330
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free  Thermo Scientific 28908
Triton™ X-100 Sigma X100
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst) Sigma 14533
Mounting medium Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 488 Conjugate; Dilution 1/100 Life technology I21411
Agrin (rabbit) ; dilution 1/400 kindly provided by Dr Markus A Ruegg
Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12) Life technology 33-9100 dilution 1:500
Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4) Sigma A2547  dilution 1:500
Anti GFAP (mouse, clone GA5) Sigma G3893  dilution 1:500
Anti AQP4 (rabbit) Sigma A5971  dilution 1:500
Anti Cx43 (mouse, Clone  2) BD Biosciences 610061  dilution 1:500
Anti Olig2 (rabbit) Millipore AB9610  dilution 1:200
Anti NF-M (mouse) provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.  dilution 1:10
Anti Iba1 (rabbit) Wako 019-19741  dilution 1:400
Alexa Fluor® 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A11029  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 488 conjugate Life technology A11034  dilution 1:2000
Alexa Fluor® 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody Life technology A21424  dilution 1:2000
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 555 conjugate Life technology A21429  dilution 1:2000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).
  2. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  3. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).
  4. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  5. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Hall, C. N., Reynell, C., et al. Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease. Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).
  8. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  9. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  10. Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation. Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).
  11. Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
  12. Iadecola, C., Nedergaard, M. Glial regulation of the cerebral microvasculature. Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).
  13. Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex. Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).
  14. Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -. M., Declèves, X. Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy. Brain Research. 1134, 1-11 (2007).
  15. Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier. Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745 (1991).
  16. Boado, R. J., Pardridge, W. M. The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier. Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).
  17. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells. PLoS ONE. 5 (10), e13741 (2010).
  19. Zhang, Y., Chen, K., et al. An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.. The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  20. Boulay, A. -. C., Saubaméa, B., et al. The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9 (2015).
  21. Boulay, A. -. C., Mazeraud, A., et al. Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43. The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).
  22. Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection. Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).
  23. Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).
  24. Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time. Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).
  25. Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Central nervous system pericytes in health and disease. Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).
  26. Ezan, P., André, P., et al. Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).
  27. Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).
  28. Dubois, L. G., Campanati, L., et al. Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418 (2014).
  29. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  30. Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544 (1978).
  31. Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents. Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).
  32. Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier. Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).
  33. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  34. Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. Purification of endothelial cells from rat brain. Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).
  35. Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels. J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).
  36. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  37. Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. Primary culture of capillary endothelium from rat brain. In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).
  38. Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
  39. Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells. Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).
  40. Warren, M. S., Zerangue, N., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  41. Geier, E. G., Chen, E. C., et al. Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).
  42. Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).
  43. Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier. Sci Rep. 3, 1500 (2013).

Tags

Brain VasculatureBlood-brain BarrierBrain PathologiesCerebrovascular PhysiologyPrimary CultureCell SortingBrain Vessel PurificationEndothelial CellsTight JunctionsBasal LaminaPericytesSmooth Muscle CellsAstrocyte EndfeetImmunostaining
check_url/kr/53208?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Boulay, A., Saubaméa, B., Declèves, X., Cohen-Salmon, M. Purification of Mouse Brain Vessels. J. Vis. Exp. (105), e53208, doi:10.3791/53208 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image