Studiare comunità microbiche<em> In Vivo</em>: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em> Candida Albicans</em> E<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Nei Airways

Summary

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Abstract

Studiare interazione ospite-patogeno ci permette di comprendere i meccanismi alla base della patogenicità microbica durante l'infezione. La prognosi di accoglienza dipende dal coinvolgimento di una risposta immunitaria adeguata contro l'agente patogeno ^1. La risposta immunitaria è complesso e risultati di interazione degli agenti patogeni e diversi tipi cellulari del sistema immunitario o non immuni ^2. Studi in vitro non possono caratterizzare queste interazioni e concentrarsi su interazioni delle cellule-patogeno. Inoltre, nelle vie respiratorie ^3, in particolare nei pazienti con malattia polmonare cronica suppurativa o nei pazienti in ventilazione meccanica, le comunità polimicrobiche sono presenti e complicano interazione ospite-patogeno. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans sono entrambi problema patogeni ^4, spesso isolati da campioni tracheobronchiale, e associato a gravi infezioni, soprattutto nel reparto di terapia intensiva ^5. Interazioni microbiche hannostato segnalato tra questi agenti patogeni in vitro, ma l'impatto clinico di queste interazioni non è chiara ^6. Per studiare le interazioni tra C. Albicans e P. aeruginosa, un modello murino di C. colonizzazione albicans vie respiratorie, seguita da una P. è stata eseguita infezione polmonare acuta aeruginosa- mediata.

Introduction

Modelli animali, soprattutto topi, sono stati ampiamente utilizzati per esplorare risposte immunitarie contro gli agenti patogeni. Anche se l'immunità innata e acquisita diversa tra roditori e nell'uomo ^7, la facilità di allevamento e lo sviluppo di fori per numerosi geni, i topi fanno un ottimo modello per studiare le risposte immunitarie ^8. La risposta immunitaria è complesso e può derivare dalla interazione di un agente patogeno, la flora residente microbica e diversi immunitarie (linfociti, neutrofili, macrofagi) e non immunitarie (cellule epiteliali, cellule endoteliali) tipi cellulari ^2. Studi in vitro non consentono l'osservazione queste interazioni complesse e si concentrano principalmente sulle interazioni uniche cellula-patogeno. Mentre modelli animali devono essere usati con cautela e limitate a domande molto specifiche e pertinenti, modelli murini forniscono una buona conoscenza della risposta immunitaria mammifero in vivo e possono riguardare parti di importanti quesiti clinici ^7.

<p class="jove_content"> Nelle vie aeree, la comunità microbica è complesso associando un gran numero di diversi microrganismi ^6. Mentre ciò che costituisce un "normale" microbioma vie aeree rimane da stabilire, le comunità residenti sono spesso polimicrobiche, e provengono da diverse fonti ecologiche. I pazienti con malattia suppurativa cronica polmonare (fibrosi cistica, bronchectasis) o pazienti in ventilazione meccanica presentano una particolare flora dovuta alla colonizzazione delle vie aeree da parte di microrganismi dell'ambiente acquisite ^9. Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans sono entrambi problema patogeni ^5, spesso isolata insieme da campioni tracheobronchiali , e responsabile di una grave infezione opportunistica in questi pazienti, in particolare nel reparto di terapia intensiva (ICU) ^4.

L'isolamento di questi microrganismi durante polmonite acuta nei risultati di terapia intensiva in trattamento antimicrobico contro P. aeruginosa blievito ut non sono di solito considerato patogeno in questo sito ^5. le interazioni in vitro tra P. aeruginosa e C. albicans sono state ampiamente riportate e ha dimostrato che questi microrganismi possono influenzare la crescita e la sopravvivenza di loro ma studi non avrebbero potuto concludere se la presenza di C. albicans è dannosa o benefica per l'host ^10. Modelli di topo sono stati sviluppati per affrontare questa rilevanza di P. aeruginosa e C. albicans in vivo, ma l'interazione tra i microrganismi non era il punto chiave. In effetti, il modello è stato istituito per valutare il coinvolgimento di C. albicans in risposta immunitaria, e il risultato.

Un modello precedente stabilito dalla Roux et al già utilizzato un colonizzazione iniziale con C. albicans seguito da un'infezione polmonare acuta indotta da P. aeruginosa. Usando il loro modello, gli autori hanno trovato un ruolo deleterio di prior C. albicans colonizzazione da ^11. Tuttavia Roux et al ha utilizzato un carico elevato di C. albicans nel loro modello con 2 x 10 ^{6 CFU} / topo durante 3 giorni consecutivi. Abbiamo stabilito un modello di 4 giorni di C. albicans colonizzazione delle vie aeree, o almeno la persistenza senza danno polmonare, in questo modello C. albicans è stato recuperato fino a 4 giorni dopo una singola instillazione di 10 ⁵ CFU per mouse (Figura 2B) ^12,13. Dopo 4 giorni, è stata osservata alcuna evidenza di reclutamento di cellule infiammatorie, la produzione di citochine infiammatorie né danno epiteliale. A 24 – 48 ore, in presenza di C. picco albicans, anche se è stata osservata una risposta immunitaria innata cellulare e citochine, non vi era alcuna evidenza di danno polmonare. Sorprendentemente, i topi così colonizzato con C. albicans 48 ore prima endonasale instillazione di P. aeruginosa era attenuato infezione rispetto ai topi con P. infezione aeruginosa da solo. ioel resto, i topi esposti danno polmonare minore e una diminuzione della carica batterica ^12,13.

Diverse ipotesi potrebbe spiegare questo effetto benefico della colonizzazione prima con C. albicans su P. aeruginosa mediata infezione polmonare acuta. In primo luogo, un cross-talk interspecie che coinvolge ogni microrganismi sistemi quorum sensing, il P. basato homoserinelactone- Sistema aeruginosa e la base farnesolo-C. Sistema albicans, sono stati valutati. Second, C. albicans agisce come bersaglio "esca" per P. aeruginosa deviare patogeno da cellule epiteliali polmonari è stata studiata. Entrambe le ipotesi sono state invalidate (dati non pubblicati). La terza ipotesi è quella di un "priming" del sistema immunitario innato da C. albicans responsabile di una successiva risposta innata maggiore contro P. aeruginosa. Quest'ultima ipotesi è stata confermata. Infatti C. colonizzazione albicans ha portato ad un adescamento di immunità innata through IL-22, secreta principalmente dalle cellule linfoidi innate, con conseguente aumento della clearance batterica e riduce il danno polmonare ^12.

In conclusione, il padrone di casa è un attore centrale nell'interazione tra microrganismi che modulano la risposta immunitaria innata e che coinvolgono diversi tipi di cellule infiammatorie. Mentre queste interazioni immunitario complessi possono essere sezionato in vitro le ipotesi iniziali possono essere forniti unicamente da appropriati modelli in vivo. Il protocollo che segue fornisce un esempio di studio in vivo del patogeno host-mediata, che può essere adattato per altri microrganismi.

Protocol

Il comitato regionale etico regionali per esperimenti su animali ha approvato questo metodo, in accordo con cura nazionale e internazionale degli animali e l'uso di linee di ricerca in fase di sperimentazione. 1. Raccolta dei campioni Conservazione del campione Raccogliere tutti i campioni e immediatamente conservare a – 20 ° C o su ghiaccio fino magazzini frigoriferi per evitare il deterioramento. Posizionare fosfato sterile salina tamponata (PBS) su ghiaccio per mi…

Representative Results

Come visto in precedenza durante la descrizione del protocollo, l'esperimento ha bisogno di 5 giorni a completare (Figura 1: esperimento temporale). Un operatore viene sollecitato durante l'intera esecuzione dell'esperimento e può gestire i processi fino ad un massimo di 10 topi. Se sono necessari più animali, sono necessarie due persone in particolare per la raccolta del campione chirurgico. In effetti tutti i campioni devono essere raccolti in meno di 2 ore al fine di evitare un aumento …

Discussion

I modelli animali, in particolare i mammiferi, sono utili per chiarire i meccanismi complessi di interazione ospite-patogeno nei campi di immunità. Naturalmente, la necessità di informazioni ottenibili solo dai modelli animali devono essere essenziale; altrimenti, l'uso di animali deve essere sostituito da modelli in vitro. Questo modello animale illustra l'intuizione che può essere fornita solo da un modello animale in quanto l'interazione tra gli agenti patogeni è mediata da una rispo…

Materials

Sevorane, Sevoflurane	Abott	05458-02	250 mL plastic bottle
Fluorescence Reader Mithras  LB940	Berthold Technologies	reference in first column	no comment
Bromo-cresol purple agar	Biomerieux	43021	x20 per unit
Pentobarbital sodique 5,47%	CEVA	6742145	100 mL plastic bottle
2-headed valve	Distrimed	92831	no comment
Sterile inoculation loop 10 µL	Dutscher	10175	x1000 conditioning
Insuline syringes 1 mL	Dutscher	30003	per 100 conditioning
2 positions Culture tube 8 mL	Dutscher	64300	no comment
Ultrospec 10	General Electric life sciences	80-2116-30	no comment
Hemolysis tubes 13 x 75 mm	Gosselin	W1773X	per 100
PBS – Phosphate-Buffered Saline	Life technologies	10010023	packaged in 500 mL
amikacin 1g	Mylan	62516778	per 10
Heparin 10 000 UI in 2 mL	Pan pharma	9128701	x 10 per unit
RAL 555 coloration kit	RAL Diagnostics	361550	3 flacons of 100 mL
1,5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt	55.526.006	x  1000
Transparent 300 µL 96-well plate	Sarstedt	82 1581500	no comment
Yest-peptone-Dextrose Broth	Sigma	95763	in powder
FITC-albumin	Sigma	A9771	in powder
Luria Bertani Broth	Sigma	L3022	in powder
25-gauge needle	Terumo or unisharp	A231	x100 conditioning
Cytocentrifuge	Thermo Scientific	A78300003	no comment