タンパク質 - 小分子標的薬のスクリーニングのための迅速かつ定量的蛍光法
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
我々は、AuのNCによって放出された差動蛍光信号に基づいて、薬物を装填タンパク質内金（Au NCS）蛍光金ナノクラスターを形成することにより、標的タンパク質に小薬物分子の結合親和性を決定するための新薬のスクリーニング方法を実証します。例えば、ヒト血清アルブミン（HSA）およびウシ血清アルブミン（BSA）などのアルブミンタンパク質は、モデルタンパク質として選択されます。アルブミンタンパク質に対する異なる結合親和性の四つの小分子薬 （例えば、イブプロフェン、ワルファリン、フェニトイン、およびスルファニルアミド）がテストされます。これは、変性条件（ すなわち 、60°Cまたは尿素の存在下）下で薬物ロードアルブミンタンパク質内部の蛍光金NCの形成速度を（薬物なし）自然のままのタンパク質内に形成されたものよりも遅いことが判明しました。また、として形成されたNCの蛍光強度は逆に、アルブミンタンパク質に対するこれらの薬剤の結合親和性に相関することが見出されています。特に、金のNC形成の速度より遅い、薬物 – タンパク質結合親和性より高い、したがって、結果として得られる金NCの低い蛍光強度が観察されます。結果として得られる金NCの蛍光強度は、したがって、テストした異なる薬剤の相対的な結合強度の単純な尺度を提供します。この方法は、単に一定のタンパク質濃度でタンパク質にプリロード薬物含有量を変化させることによって、特異的な薬物-タンパク質結合定数（K D）を測定するために拡張可能です。測定結果は、他の威信が、より複雑な方法を用いて得られた値とよく一致します。
Introduction
例えば、ヒト血清アルブミン（HSA）およびウシ血清アルブミン（BSA）などの血清アルブミンは血漿中で最も豊富なタンパク質であり、血液区画の浸透圧の維持に重要な役割を演じます。それらはまた、ステロイド、脂肪酸、甲状腺ホルモン、および薬物の広範囲のような低水溶性の小分子のための担体タンパク質として認識されています。アルブミン血清するために、これらの分子の結合特性（例えば、結合部位は、結合親和性や強度）は、薬物動態における重要なトピックとなっている。1-4、いくつかの分析方法は、アルブミン、血清するために、異なる薬剤の結合特性を研究するために開発された、などX線結晶学、5,6-核磁気共鳴（NMR）、7-11、および表面プラズモン共鳴（SPR）、12,13等しかしながら、これらの方法は、面倒で時間のかかる解 析処理（どちらかによって制約され、例えば 、X線crystalloための単結晶の成長グラフィック研究）、特殊で高価な機器の要件（SPR）、または検出のための高価な同位体標識（NMR）を必要としました。これは、高速、単純で、かつコスト効率的な方法で低分子薬物スクリーニングのための別の方法を開発することが非常に望ましいです。
金ナノクラスター（金のNC）が2ナノメートルよりも小さいサイズの金属原子の十を含有する、ナノ材料の特殊なタイプです。14-17彼らは、ディスクリートおよびサイズ依存電子構造に起因する大規模な研究関心を集めている、18、 19と分子状の吸収と排出。20-23そのような固有の材料特性は、特に、強い蛍光は、生体系におけるそのような感知およびイメージングのような多様な用途が見出されている。24-32超小型蛍光金のNCは、機能性タンパク質を使用して合成することができますこのようなテンプレートとして血清アルブミン、など。33の典型的なタンパク質-テンプレート合成で金NCS、金塩の一定量の第一のタンパク質の内部にカプセル化され、続いてタンパク質自体によって低減されます。タンパク質の還元能力は、アルカリ性溶液のpHを増加させることによって活性化することができる機能性アミノ酸残基（例えば、チロシン）の構成要素に起因します。タンパク質構造のアンフォールディングは、金NCの形成のための重要なステップであると考えられます。折り畳まれていないタンパク質に、より多くの還元性官能基は、カプセル化された金塩に曝露することができるからです。アンフォールディングタンパク質は、熱処理または変性剤に曝露することによって達成することができます。小分子薬物はまたすなわち中点変性温度と、これらすべての要因の。34,35効果展開のエンタルピーを変更する、展開プロセスに影響を与える可能性の導入は、次に、蛍光金NCの形成速度によって反映させることができるとで明らかに結果として得られる金NCの蛍光強度。36
e_content ">このビデオは、より高い温度（60℃）で、または変性剤の存在下で薬物負荷アルブミンタンパク質で金のNCを合成することにより、薬剤スクリーニング方法（例えば、尿素）、得られたAu NCの蛍光強度を示しています信号読み出しである。まず、金のNCは、金のNC。第二の生成速度に影響を与えるタンパク質は（熱処理または変性剤によって誘導される）アンフォールディングする方法を示すために、60℃で、または尿素の存在下で処理したHSAとBSAテンプレートに合成され、金のNCは、異なる薬物でプリロードタンパク質鋳型で合成され、得られたAu NCの相対蛍光強度に対する薬物負荷効果は相対的結合強度の尺度を提供する、研究されている。最後に、金NC-薬物スクリーニングプロトコルのために修正されます一定濃度のタンパク質にプリロード薬物含有量を変化させることにより、薬物-タンパク質結合定数（K D）の定量的測定。Protocol
Representative Results
Discussion
この方法で強調表示される必要があるいくつかの重要なステップがあります。別の小分子薬、ステップ3.1.2、3.1.3、および3.1.4の相対的結合親和性をスクリーニングするプロトコルでは相対的な結合強度のための一貫した傾向を示す良い結果を得るために重要です。これらの手順では、化学物質を添加して測定用反応液を描画するアクションは、時間遅れ効果と化学薬品を添加して測定用の反?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
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