사용<em> 전의 VIVO</em> 전체 태아 기관의 강직 한 방울 문화 마우스 기관 형성 기간 동안 발달 프로세스를 연구
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
자궁의 기관 형성을 조사하면 자궁 내에서 개발 배아에 의한 시약의 어려움에 태반 포유 동물에서 기술적으로 어려운 과정이다. 새로 개발 된 생체 똑바로 방울 문화 방법은 자궁 내에서 수행 연구에 매력적인 대안을 제공합니다. 생체 액적 배양 검사 및 다양한 차단 및 활성화 화합물의 사용을 통해 세포 상호 작용 및 다양한 신호 전달 경로를 조작하는 능력을 제공; 부가 적으로, 특정 기관의 개발에 다양한 약리 시약의 효과는 자궁 내 전신성 약물 투여의 부작용없이 조사 할 수있다. 시험 관내 시스템에서 다른 비교하여, 액적 배양 포유 동물 세포주에서 복제 될 수없는 삼차원 형태 형성 및 세포 – 세포 상호 작용을 연구하는 능력을 가능하게 할뿐만 아니라 (R)를 훨씬 적게 요구뿐만생체 전 다른 것보다 체외 프로토콜에 eagents. 본 논문은 방법의 효과를 입증하기 위해 전체 장기 면역 다음에 적절한 마우스 태아의 장기 해부 및 수직 방울 배양 기술을 보여줍니다. 생체 액적 배양법 유사한 생체 내에서 관찰되며, 생체 내 모델에서 배아 치 명성에 기인 달리 어려운 학습 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있는지에 대한 장기 구조의 형성을 허용한다. 모델 시스템과 같은 어플리케이션, 소분자 억제제는 고환 혈관의 형태 형성의 역할을 조사하기 위해 이용 될 것이다. 각 기관에 광범위하게 될 어떤 프로토콜 기관 특이 수정을 결정하기 위해 검토되어야하지만,이 생체 액적 배양법, 예컨대 폐 및 잠재적으로 다른 기타 태아 기관 시스템까지 확장된다. 이 기관 배양 물 시스템은 태아의 장기와 실험에 유연성을 제공하고, 결과 obtaineD 연구자들은 태아의 개발에 대한 통찰력을 얻을 도움이 될 것입니다이 기술을 사용.
Introduction
인간의 생체에서 장기 재생은 매우 제한적이다 따라서, 조직 공학, 조직 및 호스트에 의해 기증 개별 세포로부터 장기 개발, 장기 교체 매력적인 잠재적 치료되고있다. 이 치료 전략이 성공하려면 그러나, 요인과 기관의 형태 형성에 관여하는 세포의 상호 작용은 철저하게 공부해야 잘 이해했다. 전통적인 접근 방식과 특정 장기의 개발을 연구 할 수 없기 때문에, 연구자들은 대체 전체 배아 또는 전체 기관 배양에 돌았 다. Kalaskar 등. 1은 체외 배양 방법은 기관 형성 연구에 대한 실현 가능한 대안 제시, 자궁 개발에 (배양 된 배아의 58 %에서) 그 생체 전체 배아 문화가 유사한 결과를 얻을 보여 주었다.
개별적인 기관 배양 시스템 등이 생체 DRO시약 또는 약물 항체의 첨가를 통해 특정한 신호 경로 또는 세포 상호 작용의 조작을 허용하면서 plet 배양 시스템은 전신 효과의 전체 기관 독립 분석을 허용한다. 전통적으로, 태아 기관 개발 연구는 모체 약물 전달 시약 이외에, 트랜스 제닉 마우스와 녹아웃 기술에 한정되어왔다. 그러나, 생체 내에서 이러한 기술과 치료에 관련된 기술적 인 문제가있다; 대부분의 문제는 종종 배아 치사를 초래 동시에 여러 장기에 영향을 미치는 영향을 중심으로 돌고. 태아의 발달을 조작하는 연구의 또 다른 관심사는 약리학 등의 시약은 태반 장벽을 통과 할 수있는 경우 (예, 약물의 산모 대사는 배아에 도달하기 전에) 및 자궁 내 배아 발달에 약물의 모성 효과입니다.
전체 기관 배양 기술은 기재된여기서 전체 태아 생식선이 생체 직립 액적 배양 배양 된 제 Maatouk 외. (2)에 의해 설명 된 프로토콜에서 적응시켰다. 태아 생식선을 배양 한 가지 중요한 이점은 소분자 억제제가 용이 단순 확산에 의해 전체 기관에 액세스 할 수 있다는 것이다. . DeFalco 등은 소분자 억제제와 결합이 생체 액적 배양 방법을 활용하는 것은 프로세스 및 생식선 3 개발 중에 발생하는 상호 작용을 시그널링 연구하기 위해 사용될 수 있음을 보여 주었다; 이러한 프로세스는 기술적 문제로 생체 내에서 검사하기 어려운 것 (예를 들어, 태반 또는 유전 또는 약리학 적 접근 방식을 사용하여 여러 기관에 영향을 미치는 치사를 통해 약물의 통과).
액적 배양뿐만 아니라 자궁 실험의 특정 측면을 개선하지만, 그것은 또한 시험 관내 및 EX VI 위에 개선이다VO 시스템도. 그들은, 다양한 세포 유형 부족 장기 구조의 형성을 허용하는 중요한 세포 외 기질 (ECM) 성분이 부족하고, 캐스케이드 신호에서 아티팩트를 나타낼 수 있기 때문에, 형태 형성을 연구하는 세포주의 이용은 매우 곤란하다. 조직 공학은 ECM 시뮬레이션 지지체를 작성을 크게 향상했다하더라도, 신호 형성기 중 각 세포 타입에 의해 요구되는 관련하여 기술의 부족은 도전 체외 기관 시스템을 구축 할 수있다. 다른 생체 시스템은 이전에, 필터 (6), 기타 발판 매트릭스 7,8 기관 형성을 연구하기 위해 설립, 또는 더 구체적 형태 형성, 한천 4 태아 기관의 라이브 영상에 매우 성공적이었다, 5 트랜스 웰되었다. 액적 배양 시스템의 장점은 O를 덜 시약을 이용할 수있는 기능을 제공함으로써, 형태 형성의 연구를 허용한다는 것이다ften 비싸고, 또한 성장 및 시그널링 기능 9 중요 장기 표면 장력을주는.
마우스에서, 초기 고환의 형태 형성 배아 (E) 사이에 일어난 일 E11.5 및 E13.5 스테이지; 이러한 단계는 특정 성 분화에 영향을 미치는 요인을 조사하기위한 최적의 시간 윈도우를 포함한다. 정소 형성시 발생하는 중요한 프로세스 중에서 고환 코드 구조의 생성 및 정소 특정 혈관 네트워크의 형성이다. 이 생체 전체 기관 액적 배양 시스템을 이용하여, 하나는 남성 관련 혈관 신생을 변경 및 소분자 억제제의 사용을 통해 정소의 형태 형성을 억제 할 수 있다는 것을 블록 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대한 수용체의 활성; VEGF-매개 혈관 재는 고환 개발 10-12 중요하다. 이 방법은 성공적으로 다른 장기에 적용 할 수 있으며, 특정 시간을 타겟팅 할개발의 창. 전체 마운트 장기 이미징은 중요한 구조의 시각화뿐만 아니라 다양한 억제제의 투여로 인한 구조 및 세포 변화 할 수 있습니다. 중요한 것은,이 시스템은 연구자가 생체 내 표적 유전자 전략 동안 모체 약물 또는 전신 투여 중단 잠재적 교란 효과를 무시할 수 있다는 점에서 유리하다. 따라서,이 전체 기관 체외 액적 배양 시스템은 크게 태아 발달 동안 특정 기관 내의 구체적 발생할 상호 작용 및 신호를 이해하는 능력을 향상시킬 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 태아의 발달을 연구하는 많은 응용 가능성을 갖는 생체 전체 기관 방울 방법을 보여줍니다. 이 기술로 인해 배아 및 배아 치사의 잠재적 어려움을 사용하여 생체 내에서 생물학적 검사하기 어려운 문제를 해결하기위한 접근 연구원 여러 기관에 사용하고, 허용 할 수있다. 이 배양 방법은 포유 동물 세포주와 같은 접근 체외 다른 위에 추가적인 이점이 전체 기관 그?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
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