Summary

Nasal Wipes para Influenza A detecção de vírus e Isolamento de suínos

Published: December 04, 2015
doi:

Summary

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Abstract

Vigilância de vírus da gripe A em suínos é fundamental para a saúde humana e animal, porque o vírus influenza A evolui rapidamente em populações de suínos e novas estirpes estão surgindo continuamente. Suínos são capazes de ser infectado por diversas linhagens do vírus influenza A, tornando-os anfitriões importantes para o surgimento e manutenção da nova gripe A estirpes de vírus. Amostragem suínos em diversas configurações, como granjas comerciais de suínos, feiras e mercados agrícolas, de animais vivos é importante para fornecer uma visão abrangente das cepas que circulam atualmente IAV. O ante-mortem técnica de amostragem padrão-ouro atual (ou seja, coleta de swab nasal) é trabalhoso porque exige contenção física dos porcos. Toalhetes nasais envolvem esfregando um pedaço de tecido em todo o focinho do porco com o mínimo de retenção do animal. A nasal limpe procedimento é simples de executar e não requer pessoal com formação profissional ou veterinária manipulação animal. While ligeiramente menos sensível do que swab nasal, as taxas de detecção e isolamento do vírus são suficientes para fazer nasal limpa uma alternativa viável para a amostragem de suínos individuais quando são necessários métodos de amostragem de baixa tensão. O protocolo de processo descreve as etapas necessárias para coletar uma nasal viável limpe a partir de um porco individual.

Introduction

Os vírus influenza A (IAV) causam doenças respiratórias em muitas espécies, incluindo aves domésticas, suínos e seres humanos. Devido ao rearranjo da evolução viral rápida segmentado genoma IAV pode ocorrer e novas cepas IAV frequentemente surgem. Suína são uma espécie que pode servir como um recipiente de mistura para rearranjo de iAVS a partir de múltiplas espécies hospedeiras. 1 Atualmente, existem três principais subtipos de IAV normalmente circulam entre os porcos da América do Norte (H1N1, H1N2, H3N2), mas várias introduções IAV de seres humanos têm levou a extensa diversidade IAV dentro desses subtipos. 2 evolução rápida da iAVS infectam suínos tem sido evidente desde 1998, quando um recombinante triplo IAV contendo segmentos de genes de vírus humanos, aviários e suínos 3 tornou-se difundido entre os porcos nos Estados Unidos. 4 O gene interno segmentos de que IAV recombinado triplo permanecem altamente prevalente entre iAVS atualmente infectando porcos. 5

"> Em todo o mundo, IAV é uma importante causa de doenças respiratórias em suínos em que os sinais clínicos típicos incluem febre, anorexia, letargia, tosse, dificuldade para respirar, espirros, corrimento nasal e pouco ganho de peso. IAV pode ser particularmente caro para semear fazendas onde reprodutiva falha devido a febre IAV induzida e leitões fracos-nascido foram documentados 6,7. Nos Estados Unidos, IAV é comumente detectada em rebanhos suínos comerciais e extensa diversidade antigênica e genômica e evolução contínua entre IAV suína infectar tem dificultado o controle deste vírus 8-11.

Preocupações de saúde pública sobre a emergência de uma estirpe IAV pandemia resultante do rearranjo em suínos foram realizados em 2009, quando um IAV suína-linhagem contendo segmentos de genes da linhagem suína norte-americana triple-reassortant e da linhagem suína aviária do tipo Eurasian causou uma pandemia mundial em humanos 12. A pandemia do vírus (A (H1N1) pdm09), desde então,rearranjado com suínos endêmica IAV estirpes 13,14 e algumas destas estirpes recentemente rearranjado foram transmitidos de volta para os seres humanos. 15 A freqüência de eventos de rearranjo e surgimento de novas cepas IAV com potencial pandêmico faz a vigilância ativa de vírus circulando IAV em suínos imperativo, especialmente na interface suína-humano.

A interface suína-humano é importante para a transmissão bi-direcional interespécies do IAV. Humano-a-suína transmissão que ocorrem na produção suína comercial é responsável por uma grande quantidade de diversidade IAV actualmente presente na população de porcos. Feiras agrícolas são os maiores configurações para o comingling de pessoas e suína nos Estados Unidos e são locais para a transmissão zoonótica do IAV 15-21. Em 2012 conhecido, durante o surto de uma variante H3N2 IAV, 93% dos casos relatados no atendimento uma feira agrícola nos dias 15 Análise Genômica antes do início da doença.dos isolados virais de suínos de exposição em comparação com isolados humanos confirmaram transmissão zoonótica. suína 21 Exposição infectado com IAV muitas vezes não mostram sinais clínicos da doença, 21-23, indicando a necessidade de testes de diagnóstico diretos.

Amostragem de suínos visivelmente doente por si só não irá identificar com sucesso prevalência IAV em suínos e não pode ser invocado para identificar novas cepas de IAV emergentes entre suína. A vigilância ativa é absolutamente necessário para a detecção de estirpes emergentes da IAV nos suínos e para avaliar sua ameaça tanto para suínos e de saúde pública. A maioria das actividades de fiscalização do IAV são voluntárias e, portanto, são necessários métodos minimamente perturbadoras. Os três principais procedimentos de coleta de amostra ante-mortem para IAV infectar suínos são: swab nasal, fluidos orais e nasais toalhetes. As actuais recomendações para a amostragem suína indivíduo para detectar a inserção lista IAV-de fibra sintética com ponta cotonetes nas narinas como o método preferidopara recolher secreções nasais e células epiteliais. 24,25 Porque os porcos podem tentar evitar este procedimento, uma equipe de pessoal treinado deve conter suínos manualmente ou com um laço, dependendo do tamanho do animal. 26 O processo de contenção é trabalhoso para o pessoal e estressante para os porcos. Além disso, exposição suína estão freqüentemente envolvidos em várias competições em uma feira de modo a percepção de stress em um animal de competição pode fazer proprietários resistente aos esforços de vigilância.

Com probabilidades de detecção IAV que variam de 80-100% em IAV rebanhos infectados, fluidos orais tornaram-se uma alternativa popular para nasal swabs para a detecção molecular do IAV em populações de suínos. 27,28 Além disso, líquidos orais podem fornecer uma janela mais ampla de IAV detecção de swab nasal após a infecção inicial. No entanto, IAV isolamento a partir de fluidos orais tem sido problemática com apenas 50% das tentativas de isolamento de vírus, resultando em IAV recuperação. 29

Usando toalhetes nasais em vez de swab nasal durante a vigilância IAV em suínos supera as limitações descritas acima. Toalhetes nasais não requerem o uso de uma armadilha de restrição e pode ser realizada sem perturbar os animais testemunhas ou do procedimento. Treinamento técnico mínimo é necessário para coletar limpezas nasais, que permite que os profissionais não-veterinários, incluindo os proprietários de suínos, para recolher as amostras de vigilância. Toalhetes nasais foram comparadas anteriormente para esfregaços nasais para a detecção e isolamento de vírus influenza A e 30 do protocolo detalhado para este método não-invasivo de amostragem é descrito abaixo.

Protocol

Todos os suínos utilizados na coleta dos seguintes dados estavam protegidos sob O Comitê Animal Care Institucional e Use Ohio State University (uso de animais protocolo número 2009A0134-R1). 1. Preparação de Transporte Viral Médio e Coleta de Amostras Vials Adicionar 37 g de Brain Heart Infusion a 900 ml de água purificada e misturar cuidadosamente com uma vareta de agitação e um agitador magnético, enquanto se aquece a 70 ° C para dissolver completamente o pó. <l…

Representative Results

A utilização bem sucedida deste método produz TRr-PCR resulta que, acompanhada com a utilização de um controlo interno durante a extracção de ARN e TRr-PCR, mostram amostras não contêm inibidores de PCR a partir de quaisquer detritos apanhados ambiente durante a amostragem. Após a inoculação de exemplo, os poços de isolamento de vírus deve ser livre de detritos ambientais visível a partir da amostra. Há um consenso razoável entre os resultados rRT-PCR e os resultados de isolamento de vírus com o entend…

Discussion

Coleta de amostras de suínos utilizando swab nasal com ponta de poliéster tem se mostrado útil para conduzir a vigilância IAV; no entanto, a utilização do procedimento de swab nasal dificulta os esforços de vigilância devido ao uso obrigatório de um laço à contenção. Toalhetes nasais representam um refinamento de técnicas de amostragem suína atuais para minimizar o estresse sobre as pessoas e suínos durante a coleta de amostra. Enquanto o método tem sido desenvolvido e validado para exposição em ambie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work has been funded in part with federal funds from the Centers of Excellence for Influenza Research and Surveillance (CEIRS), National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contract No. HHSN272201400006C.

Materials

BBL Brain Heart Infusion Becton, Dickinson and Company 211059
Penicillin G Sodium Salt MP Biomedicals, LLC 021194537 1500 u/mg
Streptomycin Sulfate AMRESCO LLC 0382
Gentamicin Solution Mediatech, Inc. 30-005-CR 50 mg/ml
Amphotericin B Solution Fisher S 24 25 250 ug/ml
Kanamycin Sulfate Teknova K2105 5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System TPP Techno Plastic Products AG  99150
Nalgen Diagnostic Bottles Thermo Scientific 342002-9025 HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply Covidien 441211 5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in) 
Nitrile Exam Gloves Saftey Choice 19-170-010 (A-D)

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Cite This Article
Nolting, J. M., Szablewski, C. M., Edwards, J. L., Nelson, S. W., Bowman, A. S. Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine. J. Vis. Exp. (106), e53313, doi:10.3791/53313 (2015).

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