Nasal Wipes for influenza A-virus Detection og Isolering fra svin

Summary

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Abstract

Overvågning for influenza A-vira hos svin er afgørende for menneskers og dyrs sundhed, fordi influenza A-virus hurtigt udvikler sig i svin befolkninger og nye stammer løbende at opstå. Svin er i stand til at blive inficeret med diverse afstamninger af influenza A-virus gør dem vigtige værter for fremkomsten og vedligeholdelse af ny influenza A virus stammer. Stikprøver svin i forskellige indstillinger som kommercielle svinebesætninger, landbrugs messer, og levende dyr markeder er vigtigt at give et samlet overblik over aktuelt cirkulerende IAV stammer. Den nuværende guld-standard ante mortem sampling teknik (dvs. samling af podninger nasale) er arbejdskrævende, fordi det kræver fysisk tilbageholdenhed af grisene. Nasal servietter indebærer gnide et stykke stof på tværs snuden af ​​gris med minimal eller ingen fastholdelse af dyret. Den nasale tørre procedure er enkel at udføre og ikke kræver personale med faglig veterinære eller håndtering dyr uddannelse. While lidt mindre følsomme end podninger nasale, virus afsløring og isolation satser er tilstrækkelige til at gøre nasal klude et rentabelt alternativ for prøveudtagning enkelte svin, når der kræves lav stress prøveudtagningsmetoder. Proceduren protokollen skitserer de nødvendige skridt for at indsamle en levedygtig nasal tørre fra en individuel gris.

Introduction

Influenza A-vira (IAV) forårsager respiratorisk sygdom i mange arter, herunder tamfugle, svin og mennesker. På grund reassortment af segmenterede IAV genomet hurtig viral evolution kan forekomme og nye IAV stammer ofte opstå. Svin er en art, der kan tjene som en blanding fartøj til resortering af IAVs fra flere værtsarter. ¹ Der er i øjeblikket tre store undertyper af IAV almindeligt cirkulerer blandt nordamerikanske svin (H1N1, H1N2, H3N2), men flere IAV introduktioner fra mennesker har førte til omfattende IAV mangfoldighed inden for disse undertyper. ² hurtige udvikling af IAVs inficerer svin har været tydeligt siden 1998, hvor en tredobbelt reassortant IAV indeholder gen segmenter fra menneske, fjerkræ og svin virus ³ blev udbredt blandt svin i USA. ^4. Den interne gen segmenter fra den tredobbelte reassortant IAV fortsat meget udbredt blandt IAVs øjeblikket inficere svin. ⁵

"> Worldwide, IAV er en væsentlig årsag til luftvejssygdomme hos svin, hvor typiske kliniske tegn omfatter feber, anoreksi, sløvhed, hoste, anstrengt vejrtrækning, nysen, næseflåd og dårlig vægtøgning. IAV kan være særligt dyrt at så gårde, hvor reproduktive fejl på grund af IAV induceret feber og svage-fødte grise er blevet dokumenteret. ^6,7 Inden for USA, er IAV almindeligvis registreres i kommercielle svinebesætninger og omfattende antigener og genomer diversitet og løbende udvikling blandt IAV inficere svin har hæmmet kontrol af denne virus. ^8-11

Folkesundheden bekymringer om fremkomsten af ​​en pandemi IAV stamme som følge af resortering i svin blev realiseret i 2009, hvor et svin-slægt IAV indeholder gen-segmenter fra triple-reassortant nordamerikanske svin afstamning og den eurasiske aviær-lignende svin afstamning forårsagede en verdensomspændende pandemi hos mennesker. ¹² pandemisk virus (A (H1N1) pdm09) har sidenreassorted med endemisk svin IAV stammer ^13,14, og nogle af disse nyligt reassorted stammer er blevet overført tilbage til mennesker. ^15. Hyppigheden af resortering begivenheder og fremkomsten af nye IAV stammer med pandemisk potentiale gør aktiv overvågning af cirkulerende IAV virus i svin bydende nødvendigt, især på svin-menneskelige grænseflade.

Svinene-menneskelige grænseflade er vigtig for tovejs interspecies overførsel af IAV. Menneske-til-svin transmission forekommer i kommerciel svin produktion er ansvarlig for en stor mængde af IAV mangfoldighed i øjeblikket til stede i svin befolkning. Landbrugsmesser er de største indstillinger for comingling af mennesker og svin i USA og er kendt steder til zoonotiske transmission af IAV. ^15-21 i 2012 under udbruddet af en variant H3N2 IAV, 93% af tilfældene rapporteret deltagelse i en landbrugsmesse i dagene forud for indtræden af sygdom. ^15. Genomisk analyseaf virale isolater fra udstilling grise sammenlignet med humane isolater bekræftet zoonotisk transmission. ²¹ Udstilling svin inficeret med IAV ofte ikke viser kliniske tegn på sygdom, ^21-23 indikerer behovet for direkte diagnostiske tests.

Prøvetagning af synligt syge grise alene vil ikke held identificere IAV prævalens hos svin og ikke kan påberåbes for at identificere nye stammer af IAV nye blandt svin. Aktiv overvågning er absolut nødvendig for påvisning af nye stammer af IAV i svin og vurdere deres trussel for både svin og folkesundheden. De fleste IAV overvågningsaktiviteter er frivillige, og derfor er der behov for minimalt forstyrrende metoder. De tre store ante mortem procedurer for IAV inficere svin prøve kollektion er: podninger nasale, orale væsker og nasale klude. Aktuelle anbefalinger til prøveudtagning enkelte svin at opdage IAV liste indsættelse af syntetiske fibre tippes svaberprøver i næseborene som den foretrukne metodeat samle nasal sekreter og epitelceller. ^24,25 Fordi svin kan forsøge at undgå denne procedure, et team af uddannet personale skal begrænse svin enten manuelt eller med en Snare, afhængigt af størrelsen af dyret. ²⁶ tilbageholdenhed proces er besværlig for personale, og stressende for svinene. Derudover er udstillingen svin ofte involveret i flere konkurrencer på en messe, så opfattelsen af ​​tilsat stress på en konkurrence dyr kan gøre ejere resistente over for den indsats overvågning.

Med sandsynligheder for IAV detektion i området fra 80-100% i IAV inficerede besætninger, har mundvæsker blevet et populært alternativ til nasale podninger for molekylær påvisning af IAV i populationer af svin. ^27,28 Derudover kan mundvæsker tilvejebringe et bredere vindue IAV detektion end podninger nasale følgende indledende infektion. Imidlertid har IAV isolation fra orale væsker været problematisk med kun 50% af virus isolation forsøg resulterer i IAV opsving. ²⁹

Brug nasale klude i stedet for podninger nasale løbet IAV overvågning i svin overvinder begrænsningerne beskrevet ovenfor. Nasal klude ikke kræver brug af en fastholdende snare og kan udføres uden at stresse dyrene eller vidner proceduren. Minimal teknisk uddannelse er nødvendig for at indsamle nasale klude, som tillader ikke-veterinære fagfolk, herunder svin ejere, til at indsamle overvågning prøver. Nasale klude var tidligere i forhold til podninger nasale til påvisning og isolering af influenza A-virus ^{30 og} den detaljerede protokol for denne ikke-invasiv prøveudtagningsmetode er beskrevet nedenfor.

Protocol

Alle svin, der anvendes i indsamlingen af ​​de følgende data blev beskyttet i henhold til Ohio State University Institutional Animal Care og brug Udvalg (animalsk brug protokol nummer 2009A0134-R1). 1. Fremstilling af Viral Transport Medium og prøveindsamling Hætteglas Tilføj 37 g Brain Heart Infusion til 900 ml renset vand og blandes grundigt med en omrører og magnetisk omrører under opvarmning til 70 ° C helt at opløse pulveret. Autoklaver bouillonen ved 12…

Representative Results

Vellykket anvendelse af denne metode giver rRT-PCR resultater, ledsaget med anvendelse af en intern kontrol i RNA-ekstraktion og PCR-rRT, viste prøverne ikke indeholder PCR-hæmmere fra enhver miljømæssig snavs plukket under prøveudtagning. Efter prøve podning, bør virusisolering brønde være fri for synlige miljømæssige snavs fra prøven. Der er rimelig enighed mellem rRT-PCR resultater og virus isolation resultater med den forståelse, at PCR ofte giver en højere IAV positiv end virusisolering fordi PCR regi…

Discussion

Indsamling af prøver fra svin ved hjælp af polyester-tippes nasale podninger har vist sig nyttig i at gennemføre IAV overvågning; Men brugen af ​​næsepodning procedure hindrer overvågning indsats på grund af den krævede brug af en snare til tilbageholdenhed. Nasal servietter repræsenterer en videreudvikling af de nuværende prøveudtagning svin teknikker til at mindske stress på mennesker og svin under prøveindsamling. Mens metoden er blevet udviklet til og valideret i indstillingerne udstilling svin, kan…

Materials

BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Nalgen Diagnostic Bottles	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply	Covidien	441211	5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in)
Nitrile Exam Gloves	Saftey Choice	19-170-010 (A-D)