Avaliação de metástases pulmonares em Rato mamárias tumorais Models por Quantitative PCR em tempo real

Summary

Este protocolo descreve como usar quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para detectar ARNm específicos de células tumorais representam metástases no tecido do pulmão do rato.

Abstract

A doença metastática é a propagação de células tumorais malignas do local do tumor primário para um órgão distante e é a principal causa de morte do cancro associado ^1. Os lugares mais comuns de propagação metastática incluem pulmão, linfonodo, cérebro e ossos ^2. Mecanismos que conduzem metástase são áreas de intensa pesquisa sobre o câncer. Consequentemente, os ensaios eficazes para medir a carga metastático em locais distantes de metástases são fundamentais para a investigação do cancro. Avaliação de metástases do pulmão em modelos de tumor mamário é geralmente realizada por observação qualitativa bruta de tecido de pulmão a seguir a dissecção. Métodos quantitativos de avaliação de metástase está actualmente limitado a ex vivo e em técnicas de imagem com base vivo que exigem parâmetros definidos pelo usuário. Muitas dessas técnicas são em todo o organismo, em vez de nível do nível celular ^3-6. Embora os métodos de imagem mais recentes utilizando microscopia multi-fotão somos capazes de avaliar MetasTasis a nível celular ^7, estes procedimentos altamente elegantes são mais adequados para avaliar os mecanismos de difusão em vez de uma avaliação quantitativa da carga metastática. Aqui, um método in vitro simples para avaliar quantitativamente a metástase é apresentado. Usando quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR), o ARNm específico de células de tumor pode ser detectado no tecido do pulmão do rato.

Introduction

Análise de qRT-PCR, como é proposto um método para avaliar a metástase tumoral. Este método é proposto como uma alternativa para os usuários que estão interessados ​​em avaliar a metástase, mas não podem ter acesso ao equipamento específico, como in vivo equipamentos de imagem ou uma fluorescência estereoscópio capaz. Uma discussão de métodos vulgarmente utilizados é apresentada seguido por uma demonstração de como a análise de QRT-PCR pode ser usado tanto como um separado ou como um método para avaliar companheiro metástase. Este procedimento tem o potencial de fornecer uma análise quantitativa de carga metastático.

Métodos padrão de análise bruta, incluindo a visualização dos pulmões sob microscópio estereoscópico, bem como cortes seriados seguido por hematoxilina e eosina (H & E) coloração do tecido pulmonar, são quantificáveis, mas dependem fortemente de parâmetros definidos pelo usuário para a contagem ^2-5. Ao avaliar os pulmões inteiros usando um microscópio estereoscópico, metástases superfície apenas as grandes são visible e análise requer o investigador ter conhecimento razoável da estrutura anatômica pulmonar para determinar o que constitui uma lesão metastática. Marcação fluorescente de células de tumor com um marcador, tais como GFP e o uso de um microscópio estereoscópico que contém um cubo de luz com os máximos de excitação / emissão adequados (por exemplo perto de 470/510 nm para GFP) auxilia neste processo, mas apenas nódulos tumorais de superfície são detectáveis . Além disso, a fluorescência a partir de contaminação do sangue, o que é visível sob os mesmos parâmetros como GFP, pode levar a falsa identificação de possíveis lesões metastáticas.

Seccionamento do pulmão seguido por H & E coloração de visualizar metástase pulmonar é um método útil para avaliar micrometástases e outros processos microscópicos incluindo a infiltração de células imunes, mas muitas vezes requer o uso de todo o tecido pulmonar para inclusão em parafina, seccionamento, e procedimentos de coloração. Portanto, os procedimentos a jusante não são ideais seguindo este metod. Embora quantificável, este procedimento requer que o investigador para avaliar um grande número de secções de pulmão coradas por animal para assegurar que a análise é responsável por toda a estrutura 3D do pulmão. Consequentemente, este tipo de exame é demorado, pode levar a contagem de erro, e análise depende fortemente de investigador discrição.

Vários em técnicas de imagem in vivo (por exemplo, ressonância magnética, PET, SPECT) são usados ​​atualmente para executar ou testar os processos biológicos em modelos de roedores experimentais ^8. In vivo a imagem de bioluminescência é um método comum usado para adquirir uma visão bruta de metástase ^9. Esta técnica é geralmente aplicado para avaliar a presença de actividade repórter da luciferase, devido à acumulação de células tumorais, que são modificados para conter um elemento de resposta de luciferase, que residem em órgãos específicos, como na glândula mamaria depois da implantação de células de tumor e o pulmão após a metástase espontânea ¹0. A visualização da actividade de luciferase repórter é induzida pela presença de substrato luciferina (D-luciferina). A luciferase catalisa a descarboxilação oxidativa de D-luciferina para oxiluciferina gerando bioluminescência. Enquanto informativo, este método é limitado por vários factores, incluindo a estabilidade do substrato (isto é, curta meia-vida), a distribuição adequada do substrato, o qual depende da forma como é entregue a animais experimentais, e baixa sensibilidade de detecção ^9. Um mérito principal desta técnica é que é não-invasiva, pode ser realizada em animais vivos, e pode conduzir à detecção de metástases de células de tumor em vários órgãos que podem não ter sido normalmente colhido em dissecção ^9,10.

Um aspecto positivo de técnicas de imagiologia in vivo é que o tecido de pulmão não é perturbada permitindo procedimentos secundários como parafina ou como aqui apresentado, a análise de qRT-PCR. No entanto, porque qRT-PCR é theoretically uma medida mais sensível de detecção, a avaliação bruta pode não revelar baixos números de células tumorais presentes no pulmão. Embora útil, as técnicas de imagiologia descritos acima podem ser substituídos ou suplementados com o método de qRT-PCR actualmente descrito. QRT-PCR tem o potencial de proporcionar uma medida sensível de ARNm derivado de tumores dentro de um pulmão.

Protocol

O protocolo segue as diretrizes e padrões de cuidados de animais da Medical University of South Carolina (MUSC) e seu Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Lung Dissection Dissecção do tumor mamário (opcional, dependendo objetivos do estudo e se a análise do tumor primário ou veia da cauda injeção foi realizada). Euthanize rato usando uma dose letal de anestesia isoflurano acordo com IACUC e regulação universidade. Confirme a eutanásia por deslocamento cirúrgico. …

Representative Results

Além do tempo que demora a efectuar a inoculação inicial de células de tumor no animal experimental e de se realizar, na análise primária do tumor in vivo, a colheita de tecido, o isolamento do ARN e a análise qRT-PCR é um procedimento de 1-2 dias (Figura 1) . Um exemplo de análise bruta é imagiologia bioluminescente para avaliar células tumorais dentro do tecido pulmonar. Aqui, um…

Discussion

Este protocolo descreve o uso de qRT-PCR para avaliar a metástase de células de tumor mamário de pulmão utilizando um modelo de xenoenxerto de ratinho. Reconhece-se que outras técnicas, incluindo a imagem de bioluminescência, estão disponíveis e também são eficazes para detectar metástase apesar de ter os seus próprios valores e limitações. Os dados apresentados sugerem que qRT-PCR proporciona uma medida eficaz de detecção de ARNm derivado de tumor dentro de tecido pulmonar para a quantificação de met?…

Materials

2-mercaptoethanol	Fisher	BP176-100
DNAse	Thermo Scientific	EN0521
GeneJet RNA Isolation Kit	Thermo Scientific	K0732
iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR	Bio-Rad	1708841
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121
PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25636
PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human	Bio-Rad	100-25716
gapdh Primer Sequence			For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG