评价肺转移的小鼠乳腺肿瘤模型定量实时荧光定量PCR
Summary
这个协议描述了如何使用定量实时PCR（QRT-PCR），以检测表示内的小鼠肺组织转移的肿瘤细胞特异性mRNA。
Abstract
转移性疾病是从主癌症部位 到远处器官恶性肿瘤细胞的扩散和是癌症相关死亡1的首要原因。转移扩散共同位点包括肺，淋巴结，脑，骨和2。机制，推动转移是癌症研究的激烈的领域。因此，有效的试验来测量转移性负担转移遥远的站点是有助于为癌症研究。一般是由以下解剖定性观察肺组织的总评价进行乳腺肿瘤模型肺转移。评估转移的定量方法目前仅限于体外 ，并在需要的用户定义的参数基于活体成像技术。许多这些技术是在整个生物体水平，而不是在细胞水平3-6。虽然利用多光子显微镜较新的成像方法能够评估METASTASIS在细胞水平7，这些高度优雅的程序更适合于传播评估机制，而不是转移负担的量化评估。这里，一个简单的体外方法定量评估转移呈现。利用定量实时PCR（QRT-PCR），肿瘤细胞特异性mRNA可以内的小鼠肺组织中检测到。
Introduction
QRT-PCR分析，提出作为评估肿瘤转移的方法。这种方法被提出作为该有兴趣评估转移，但可能无法获得特定设备，例如在体内成像设备或荧光能立体镜用户的替代。的常用方法的讨论，提出后跟一个示范如何QRT-PCR分析可以使用，也可以作为一个单独的或作为伴侣方法来评价转移。此过程有可能提供的转移性负担进行定量分析。
总分析的标准方法，包括肺的立体显微镜下的可视化以及连续切片随后苏木精和曙红肺组织（H＆E）染色，可以量化但在很大程度上依赖于用户定义的参数，用于计数2-5。在评估整个肺使用立体显微镜，只有大面积转移是VISI竹叶提取和分析需要研究者具有肺解剖结构的合理的知识来确定什么构成转移性病灶。肿瘤细胞与一个标记例如GFP和使用包含光立方与适当的激发/发射最大值（如邻近五百一十分之四百七毫微米的GFP）在立体显微镜的荧光标记协助在此过程中，但只有表面肿瘤结节是可检测的。此外，从血液污染，这是根据相同的参数的GFP可见荧光，可能会导致可能的转移病灶误识别。
切片肺其次是H＆E染色可视化肺转移是评价微转移等微观过程，包括免疫细胞浸润的有效方法，但往往需要利用整个肺组织石蜡包埋，切片，和染色程序。因此，下游的过程是不理想的下面这个实现方法具ð。虽然量化，这个过程需要研究者评估了大量的每只动物染色肺切片，以确保分析占肺的整个3D结构。因此，这种类型的检查非常耗时，可能会导致计数误差，并分析在很大程度上依赖于研究者决定。
几个体内成像 技术 （例如MRI，PET，SPECT）目前用于执行或在实验啮齿动物模型中进行测试8的生物过程。 体内生物发光成像是用于获取转移9的总图的常用方法。这种技术通常被应用于评估荧光素酶报告活性的存在，由于肿瘤细胞，其工程化以包含一个萤光素酶应答元件，驻留在像后肿瘤细胞植入乳腺以及在自发转移肺特定器官的积累10。可视化的荧光素酶报告活性的由荧光素底物（D-萤光素）的存在下诱发。萤光素酶催化的D-荧光素的氧化脱羧以产生氧化萤光素生物发光。而信息量大，这种方法是由几个因素，包括基片的稳定性（ 即半衰期短），基板，取决于它是如何传递到实验动物的适当分配，并检测9的低灵敏度的限制。一个主要的优点在该技术是，它是非侵入性的，可以在活的动物进行的，并可能导致在多个器官肿瘤细胞转移的检测可能没有被正常收获解剖9,10。
体内成像技术之一积极方面是肺组织不受干扰允许像石蜡包埋次级步骤或如这里提出，QRT-PCR分析。但是，因为QRT-PCR是theoreticaLLY检测的更灵敏的测量，总评价可能不能揭示低号码存在于肺的肿瘤细胞。虽然有用，上述的成像技术可以被取代或补充有目前描述的QRT-PCR法。 QRT-PCR有潜力肺内提供的肿瘤来源的mRNA的一个敏感量度。
Protocol
Representative Results
Discussion
这个协议描述使用QRT-PCR，以评估乳腺肿瘤细胞转移到使用异种移植物小鼠模型中肺。应当承认，其他技术，包括生物发光成像，都可以，也是有效的，尽管有自己的价值观和限制检测转移。提出的数据表明，QRT-PCR提供了检测肺组织内的肿瘤来源的mRNA的总转移的定量的有效措施。所以建议的QRT-PCR分析提供了，可以补充或代替这些成像技术来执行辅助方法。这种技术可能最适合用于研究有限的环境…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
在星爷的实验室是支持由美国癌症协会的机构研究基金（IRG-97-219-14）从美国国防部的资助奖励给霍林斯癌症中心MUSC，由科研经费（W81XWH-11-2-科研经费0229） 在MUSC，并通过从关怀基金会（到ESY）裁决。
Materials
| 2-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| DNAse | Thermo Scientific | EN0521 | |
| GeneJet RNA Isolation Kit | Thermo Scientific | K0732 | |
| iScript Reverse Transcription Supermix for QRT-PCR | Bio-Rad | 1708841 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| PrimePCR SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25636 | |
| PrimePCR Template for SYBR Green Assay: ERBB2, Human | Bio-Rad | 100-25716 | |
| gapdh Primer Sequence | For-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAACG Rev-CGCTCCTGGAAGATGGTGATGG |
References
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