세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.
후 MsCl는 큰 전도도 mechanosensitive 채널 (MSC)는 박테리아가 갑작 저자 삼투 충격을 생존하는 데 도움이되는 유비쿼터스 osmolyte 릴리스 밸브입니다. 그것은 발견 엄격 거의 30 년 동안 패치 – 클램프 기술을 이용하여 연구되었다. 투자율 응답으로 세포막에인가 장력 번역 기본적인 역할은 인공 막 기반 장치에 생체 분자 mechanoelectrical 변환기 역할을 유력하게. 이러한 장치에 빌딩 블록으로서, 액적 인터페이스 이중층 (DIB의)는 후 MsCl 채널의 혼입 및 자극 새로운 플랫폼으로 사용될 수있다. 여기서는 인용 후 MsCl 채널의 활성을 DIB의 형성과 측정 마이크로 피펫 기반 방법을 설명한다. 이 방법은 두 상대 (동축 위치) 붕규산 유리 마이크로 피펫의 팁에 고정 지질 쌌다 수성 방울로 구성되어 있습니다. 물방울이 접촉 될 때, 지질 이중층 인터페이스이다형성했다. 이러한 기술은 화학 성분과 각각의 액적 크기를 제어 할뿐만 아니라, 이중층 인터페이스의 크기를 제공한다. 고조파 압전 액츄에이터에 연결된 마이크로 피펫 중 하나를 갖는 원하는 진동 자극을 전달하는 기능을 제공한다. 변형 동안 방울의 형상을 분석 한 결과, 계면에서 생성 된 장력을 추정 할 수있다. 이 기술을 사용하여, DIB 시스템 후 MsCl 채널들의 제 활성이보고되어있다. MS 채널 외에 채널의 다른 유형의 활동이 플랫폼의 다중 기능을 증명하는,이 방법을 이용하여 연구 할 수있다. 여기에 제시된 방법은, 기본 막 특성의 측정을 가능하게 대칭 및 비대칭 막의 형성을 통해 더 큰 제어를 제공하고, 자극 mechanosensitive 채널을 연구하는 또 다른 방법이다.
지난 10 년간, 인공 지질 이중층의 조립체는 실질적 액적 인터페이스 이중층 방법의 개발로 발전되고있다. 안정적이고 견고한로 알려진, DIB의은 (뮐러) 그린 고전 접혀 (Montal – 뮐러) 평면 이중층 1 대안 모델 시스템으로 자신을 부과했다. 지질 이중층을 만드는 방울을 사용하는 개념은 1960 년대로 거슬러 2 있지만, 최근까지 인기를 얻고 않았다. 최초의 성공적인 시도는 베일리 그룹 4-6에 의해 소적의 네트워크를 사용하는 이중층의 형성을 보여주는 여러 연구 하였다 Takeushi 군 (3)에 의해보고되었다. 보다 최근에는, 밀봉 기술은 새로운 자극에 반응하는 물질 시스템 (10)의 빌딩 블록으로 DIB의 사용의 개념을 개척 레오 그룹 7-9에 의해 제안되었다. 이전 연구에서, DIB의 전기 9,11, 화학 반응 할 수있는 능력을 입증10, 12의 iCal, 광 자극 (13). DIB 10, 14에서 재구성 할 때 다른 자극에 반응하는 기능을 가진 다양한 생체 분자를 효과적으로 자극하고있다. 중요한 문제가 발생이 성공적인 시도에 비추어 : 기계적인 자극에 DIB의 응답이 때 적절한 생체 분자가 포함되어 있을까? DIB에 작용하는 계면 힘은 다른 이중층 시스템 (15, 16)과 다를. 따라서, 액적 보유한 이중층에 장력 물 지질 오일 계면 장력을 조절함으로써 제어 될 수있다; 페인트 또는 접힌 이중층 시스템에 적용 할 수없는 개념입니다.
널리 osmolyte 릴리스 밸브와 세균의 세포질 막의 기본 요소로 알려진 후 MsCl 채널은, 증가 된 장력 막 (17, 18)에 반응한다. 하이포 삼투압 충격의 경우에, 여러 개의 채널이 작은 셀에 존재하는 막 (19)을 생성 할 수 MAS시브 투과성 반응은 신속하게 용해 (20) 박테리아를 저장, 이온과 작은 분자를 분리합니다. Biophysically, 후 MsCl 잘 연구하고 눈에 띄는 패치 클램프 기법 21-23을 통해 주로 특징. 후 MsCl의 게이팅 메커니즘 (24, 25)을 설명하는 신뢰할 수있는 구조 모델의 동체의 크리스탈 (28) 모델링 구조 26, 27, 및 광범위한 실험 24,29-31의 결과를 바탕으로 제안되고있다. ~의 적용 긴장에서 10 mN의 / M, 횡단 나선의 꽉 번들로 구성되어 닫힌 채널은 ~ (28)의 물이 채워진 도전 기공 21,24,32를 형성 크게 기울어 나선의 고리로 변환합니다. 또한 내측 TM1 도메인의 교차점에 위치하는 게이트 타이트의 소수성은, 채널 (33)의 작동 임계 값을 결정하는 것으로 확립되어있다. 이에 대응하여, 그 발견 된 해당 게이트의 소수성을 감소시킴으로써, 장력N 임계 값 (22)을 낮게 할 수있다. 의 MsCl이 속성은 주로 약물 전달을 위해, 다양한 제어 밸브 (34)의 설계 가능. 모든 전술 특성 및 전기 생리 활동에 세포막 과도한 긴장을 번역하는 근본적인 역할에 따라, 후 MsCl는 DIB의에서 mechanoelectrical 변환기로 좋은 착용감을합니다.
이 글에서, 우리는 기계적인 자극에서 통합 후 MsCl 채널의 활동을 DIB의 형성 및 측정하는 원래의 마이크로 피펫 기반 방법을 제시한다. 우리는 처음과 DIB의 기계적 자극 (35)의 MsCl V23T 낮은 임계 변이체의 기능적 재구성 DIB의 행의 응답을보고한다.
실험 시스템은 두 개의 반대 붕규산 유리 마이크로 피펫의 팁에 고정 지질 쌌다 수성 방울로 구성되어 있습니다. 물방울이 접촉 될 때 지질 이중층 인터페이스는 fo를 인rmed. 이 기법은 각각의 액적 (벌크)의 화학 조성과 크기를 제어 할뿐만 아니라, 이중층 인터페이스의 치수를 제공한다. 또한, 각 전단 각종 지질 조성물 비대칭 막을 용이하게 형성 할 수있다. 고조파 압전 액츄에이터에 연결된 마이크로 피펫 중 하나를 갖는 미리 프로그래밍 된 단일 사이클 또는 진동 자극을 적용 할 수있는 능력을 제공한다. 장력을지지 두 방울의 압축을 통해 인공 막에 전달된다. 액적 변형의 결과로, 수분 – 지질 오일 인터페이스 증가와 동시에 물방울이 이루는 각의 영역은 막의 장력 과도 후 MsCl 활성의 증가를 초래 감소한다. 변형 동안 방울의 형상을 분석 한 결과, 계면에서 생성 된 장력을 추정 할 수있다. 이 문서의 초점은 DIB의 메카 – 전달 특성에 비록, 우리는 또한 강조 다른 종류의 바이오이러한 alamethicin 같은 분자는이 다기능 플랫폼에 의해 활성화 될 수있다. 우리는, 제조, 조립, 및 단계적인 방식으로이 새로운 방법으로 측정을 모든 기술적, 여기에 제시한다.
Mechanosensation는 생물 진화 최초의 감각 전달 경로 중 하나를 의미한다. 공부와 DIB의 전기 – 기계 특성을 이해하는데이 현상을 이용하여, 자극 – 반응 기능성 물질 향해 중요한 단계이다. 그것은 mechanoelectrical 변환기 및 지질 이중층 인터페이스 장력 증가를 검출하는 변형 게이지로서 DIB에 mechanosensitive 채널, 후 MsCl의 결합 및 활성화를 수반한다. 다른 주에, MS 채널의 기능은 두께, 극한 곡률 및 압축성을 포함한 지질 이중층의 기본 물성을 통해 조절 될 수있다. 전술의 관점에서, 마이크로 피펫 기반 기술 연구원 DIB의에서 MS 채널을 연구 및 지질 이중층의 구조뿐만 아니라, 지질 – 단백질 상호 작용에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 능력을 허용하는 유용한 도구를 제공한다.
지난 3 년간 이상들, 패치 클램프는 전압과 긴장 모두의 클램핑을 할 수 있기 때문에, MS 채널을 연구하는 기본 방법이었다. 그러나, 패치 클램프는 부피가 큰 장비 소형화, 감각 및 변환 장치의 설계에 필요한 속성에 대한 적합하지가 필요합니다. 그 단순성과 안정성, 소형화로 인해의 MsCl은 DIB의 활성을 연구하기에 적합한 환경을 나타낸다. 여기서는 액적 및 이중층 인터페이스의 크기, 각각의 방울의 화학 조성 및 동적 자극을 통해 계면 장력을 제어 할 수있는 능력과, 마이크로 피펫 기반 기술을 제안하여 DIB 형성 기법 이전 진보를 연장한다. 기술은 동축 유리 모세관 대향 팁, 테오 함유 수성 액 적을 고정 이루어져있다. 접촉 계면에서의 지질 이중층을 형성하게 할 때, 유기 용제 액의 욕조에 넣고있다.
P는 마이크로 피펫에 부착된다방울의 수평 변위를 허용 iezoelectric 발진기. 동적 물 오일 계면에서 계면 장력의 증가에 따라서 이중층 장력의 증가 방울 결과를 압축. 두 가지 주요 측면은 유사과 최근 발표 된 연락처 거품 이중층 (CBB) 기술 (37)에서이 방법을 차별화. 여기에 제공된 기술을 사용하여, 이중층의 크기가 미세 조작기를 이용하여 제어되고, 이에 따라 액 적의 볼륨 CBB 방법에서와 달리, 일정하게 유지. 또한, CBB 기술은 단순하고 구축하기 쉬워 본 논문에서 제시된 방법에서 필요하지 않은 가압 펌프를 요구한다.
우리는 통합 및 패치 피펫 또는 화학적 변형 (38)의 사용없이 처음 세균성 후 MsCl을 자극 할 수있다. 시스템은 강력한 지질 이중층 비대칭 막의 형성을 용이하게하므로,보다 밀접 L을 모방생물 세포막에서 발견 IPID 비대칭. 이것의 MsCl 활동 제어 막 조성물 또는 비대칭의 효과를 연구하기 위해있게 해준다. 또한, 화상 처리 기술을 통해,이 방법은 이중층 계면 장력을 추정 할 수 있습니다. DIB에서 벌크 및 표면 세력 사이의 상호의 원리를 이해하는데이 기술 어시스트, 기본적인 막 특성의 측정을 용이하게하고, 긴장을 막 후 MsCl 응답의 이해를 향상시킨다.
이 방법은 후 MsCl을 연구 걸음 더 가까이 생체 분자 자극 – 반응 물질 시스템을 향한와 다른 생리 학적 환경에 우리가 걸립니다 만, 시스템에 대한 제한 사항이 있습니다. 이 시스템에서의 장력으로 인해 오일 / 물 계면 장력을 완화하는 경향이 각 액적에서 리포좀 형태의 지질 저장소의 존재에 클램프 될 수 없다. 따라서, 현재의 mechanosensitive 채널에서 자극 할 수있다단지 동적 정권에서 DIB의에. 시스템에서의 기포의 존재는 상당히 실험의 정밀도 및 재현성에 영향을 준다. 하이드로 겔에 존재하는 기포는 전기 연결의 경우 손실이 발생할 수 있습니다.
우리의 MsCl 자극 마이크로 피펫 기반 방법의 사용을 설명하지만,이 기술은 MS 채널들의 다른 유형을 연구하기 위해 사용되며, 생체 분자의 다양한 연구하는 연구자에 의해 사용될 수있는 잠재력을 보유 할 수있다. 예를 들어, 유사한 설정이없는 채널 액적 인터페이스 이중층 막의 mechanoelectrical 반응을 연구하기 위해 실험에 사용되었다. 다양한 단백질을 재구성하고 각 생체 분자의 재구성 환경 변화를 고려하여 복용이 높은 제어 설정을 사용하여 활성화 할 수있다. 이 문서에서 설명하는 방법은 연구자의 상상력에 제한되어 상당히 넓은 응용 가능성에 감동.
The authors have nothing to disclose.
이 책에서보고 된 연구는 과학 연구의 기본 구상을 부여 FA9550-12-1-0464의 공군 사무실에 의해 지원됩니다.
0.22 µm filter | Corning | 430624 | |
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | Purchased as lyophilized powder |
34-gauge microfil | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
400 mL Centrifuge bottels | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
Ampicillian | ThermoFisher | BP1760 | ACS Grade |
Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | – | |
AxioCam HSm | Carl Zeiss | – | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | – | |
BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Dialysis tubing | 7 Spectra/Por | 132113 | MWCO 8000, 7.5 mm diameter |
DigiData 1440A system | Molecular Devices | – | |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DPhPC | Avanti | 850356C | |
E-625 PZT Servo-Controller | Physik Instrumente | E-526 | |
FPLC System | Pharmacia Biotech | – | |
HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
Homoginizer | Wheaton | 357426 | 15 mL |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Affymetrix | 17886 | |
IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
Isopore Membrane Filters | EMD Millipore | VCTP02500 | |
Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS Grade |
KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS Grade |
Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
LED-100 UV Spot Curing System | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Manual Patch-Clamp Micromanipulators | Thorlabs | PCS-520N | |
MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS Grade |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
MOPS, minimum 99.5% titration | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
N2 Gas | Airgas | UN1066 | |
NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS Grade |
Ni NTA agarose beads | Qiagen | 1000632 | |
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID | McMaster-Carr | 8486K545 | |
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator | Physik Instrumente | P-601 | |
PAGE gel | Bio-Rad | 456-9033 | |
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film | Parafilm® | PM999 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
Replacement Gasket 1.0mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
Sodium Azide | Affymetrix | 21610 | |
Test tubes | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 x 130 mm |
Tryptone | ThermoFisher | BP1421 | |
Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 MWCO |
VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 | |
Water Purifier | Barnstead | D11931 | |
Yeast | ThermoFisher | BP1422 | |
β-octylglucopyranoside | Anatrace | O311S |