Kan brukes bakterie mechanosensitive kanaler som mechanoelectrical transdusere i biomolekylære enheter. Dråpe grensesnitt bilag (DIBS), celle-inspirerte byggesteinene til slike enheter, representerer nye plattformer å innlemme og stimulere mechanosensitive kanaler. Her viser vi en ny mikropipette-basert fremgangsmåte for å danne dibs, slik at studiet av mechanosensitive kanaler under mekanisk stimulering.
MsCl, en stor ledningsevne mechanosensitive kanal (MSC), er en allestedsnærværende osmolyte utløsningsventil som hjelper bakteriene overlever brå hypo-osmotisk sjokk. Det har blitt oppdaget og strengt studert ved hjelp av patch-clamp teknikk for nesten tre tiår. Dens grunnleggende rolle sette spenning påføres til cellemembranen inn i permeabilitet respons det er en sterk kandidat for å fungere som en mechanoelectrical transduser i kunstige membran-baserte biomolekylære enheter. Visning som byggesteiner til slike enheter, kan dråpe grensesnitt dobbeltlag (DIBS) brukes som en ny plattform for inkorporering og stimulering av MsCl kanaler. Her beskriver vi en mikropipette basert metode for å danne dibs og måle aktiviteten av de inkorporerte MsCl kanaler. Denne metoden består av lipid-innkapslet vanndråper forankret til tuppen av to motstridende (koaksialt posisjon) borsilikatglass mikropipetter. Når dråpene bringes i kontakt, i en lipid bilag-grensesnittdannet. Denne teknikken gir kontroll over den kjemiske sammensetningen og størrelsen av hver dråpe, så vel som dimensjonene av bilaget grensesnittet. Ha en av de mikropipetter festet til en harmonisk piezoelektrisk aktuator gir muligheten til å levere en ønsket svingnings stimulus. Gjennom analyse av former av dråpene under deformasjon, kan den i spenn ved grenseflaten estimeres. Ved hjelp av denne teknikken, er den første aktivitet av MsCl kanaler i et system DIB rapportert. Foruten MS kanaler, kan virksomheten til andre typer kanaler bli studert ved hjelp av denne metoden for å bevise at multi-funksjonaliteten til denne plattformen. Metoden som presenteres her muliggjør måling av egenskaper fundamental membran, gir en bedre kontroll over dannelsen av symmetriske og asymmetriske membraner, og er en alternativ måte for å stimulere og studere mechanosensitive kanaler.
I det siste tiåret har monteringen av kunstige lipidbilag blitt vesentlig avanserte gjennom utviklingen av dråpe grensesnittet bilaget metoden. Kjent som stabil og robust, pålegges DIBS seg som alternative modellsystemer til den klassiske malt (Mueller) og foldet (Montal-Mueller) planar bilag 1. Selv om ideen om å bruke dråper å skape lipidbilag dateres tilbake til 1960-tallet 2, har det ikke fått popularitet inntil nylig. Den første vellykkede forsøk ble rapportert av Takeushi gruppe 3, etterfulgt av flere studier som viser bilagsdannelse ved hjelp av et nettverk av små dråper av Bayley gruppe 4-6. Mer nylig ble innkapslingsteknikker foreslått av Leo gruppe 7-9, som var en pioner konseptet med å bruke DIBS som byggeklosser av nye stimuli-responsive materielle systemer 10. I tidligere studier har DIBS bevist sin evne til å svare på elektrisk 9,11, chemical 10,12, og optisk stimuli 13. Ulike biomolekyler med ulike stimuli-responsive funksjoner har blitt effektivt stimulert når tilberedt i DIB 10,14. I lys av disse vellykkede forsøk et viktig spørsmål blir reist: kunne DIB reagerer på mekanisk stimulans når egnede biomolekyler er innarbeidet? Grenseflate krefter som virker på en DIB forskjellige fra de i andre dobbeltlag system 15,16. Derfor kan spenningen i bilaget holdt av dråpene reguleres ved å regulere spenningen på vann-lipid-oljegrenseflater; et konsept ikke aktuelt med malte eller brettet bilags systemer.
MsCl kanaler, viden kjent som osmolyte slipper ventiler og grunnleggende elementer av bakteriell cytoplasmamembranen, reagerer på økt membran spenning 17,18. I tilfelle av hypo-osmotiske sjokk, flere kanaler bosatt i membranen av en liten celle 19 kan generere en massive permeabilitet respons til raskt frigjøre ioner og små molekyler, sparer bakterier fra lyse 20. Biophysically, MsCl er godt studert og karakterisert primært gjennom fremtredende patch clamp teknikken 21-23. Pålitelige strukturelle modeller som forklarer MsCl sin portmekanisme 24,25 foreslås basert på sin homolog krystallstruktur 26,27, modellering 28, og resultatene av omfattende eksperimentering 24,29-31. I henhold til en påført spenning på ~ 10 mN / m, lukket kanal, som består av en tett bunt av transmembran-helikser, transformeres inn i en ring av sterkt vinklet helikser som danner en ~ 28 en vannfylt pore ledende 21,24,32. Det er også blitt fastslått at hydrofobisiteten til tett port, plassert i skjæringspunktet mellom de indre TM1 domenene, bestemmer aktivering terskelen av kanalen 33. Tilsvarende ble det funnet at ved å redusere hydrofobisiteten av porten, den tension terskel kunne senkes 22. Denne egenskapen av MsCl gjort mulig utforming av forskjellige styrbare ventiler 34, primært for medikamentleverings formål. For alle de nevnte egenskapene, og basert på sin grunnleggende rolle sette cellemembranen dreven spenninger i elektrovirksomhet, gjør MsCl en flott plass som en mechanoelectrical svinger i Dibs.
I denne artikkelen presenterer vi en original mikropipette basert metode for å danne DIBS og måle aktiviteten av de inkorporerte MsCl kanaler under mekanisk stimulering. Vi rapporterer for første gang, responsen fra DIBS til mekanisk stimuli og funksjonell rekonstituering av V23T lavterskel mutant av MsCl i Dibs 35.
Den eksperimentelle systemet består av lipid innkapslet vanndråper forankret til tuppen av to motstridende borsilikatglass mikropipetter. Når dråpene bringes i kontakt med en lipid bilag-grensesnitt er foRMED. Denne teknikken gir kontroll over den kjemiske sammensetningen og størrelsen av hver dråpe (bulk), så vel som dimensjonene av bilaget grensesnittet. I tillegg kunne asymmetriske membraner med forskjellig lipid sammensetning i hvert blad lett bli dannet. Ha en av de mikropipetter festet til en harmonisk piezoelektrisk aktuator, gjør det mulig å anvende en forprogrammert enkelt syklus eller oscillerende stimulus. Spenningen blir levert til den kunstige membran gjennom komprimering av begge dråper som støtter den. Som et resultat av dråpedeformasjon, de områdene av vann-lipid-olje-grensesnitt øke, og samtidig vinkelen mellom dråpene synker, forårsaker en økning i membran spenning og forbigående MsCl aktivering. Gjennom analyse av former av dråpene under deformasjon, kan den i spenn ved grenseflaten estimeres. Selv om fokuset i denne artikkelen er på mekanisk-transduksjon egenskapene til DIB, vi også understreke at andre typer biomolekyler, slik som alamethicin, kan bli aktivert av denne multi-funksjonelle plattform. Vi presenterer her, alle de tekniske aspektene ved utarbeidelse, montering, og ta målinger med denne nye metoden i en steg-for-steg måte.
Mechanosensation betegner en av de første sensoriske overføringsveier som utviklet seg i levende organismer. Ved hjelp av dette fenomenet for å studere og forstå Mekano-elektriske egenskapene til DIB, er et avgjørende skritt mot funksjonelle stimuli-responsive materialer. Det innebærer inkorporering og aktivering av en mechanosensitive kanal, MsCl, i DIB som en mechanoelectrical transduser, og en strekkmåler for å detektere spenning økning i lipid bilaget grensesnittet. På et annet merke, kan funksjonen av MS kanaler reguleres gjennom de grunnleggende materialegenskaper lipiddobbeltlag inkludert tykkelse, egenverdi kurvatur, og kompressibilitet. I lys av ovennevnte, tilveiebringer mikropipette basert teknikk et verdifullt verktøy slik at forskeren evnen til å studere MS kanaler i Dibs og gir innsikt i strukturen i det ytre lipid bilaget, samt lipid-protein interaksjoner.
Over de siste tre tiårs, patch-clamp var den primære metode for å studere MS kanaler, da den tillater fastklemming av både spenning og strekk. Men patch-clamp krever noe utstyr og ikke egnet for miniatyrisering, en egenskap som kreves for prosjektering av sensoriske og konvertering enheter. Dibs på grunn av sin enkelhet, stabilitet og kompakthet representerer et egnet miljø for å undersøke aktiviteten av MsCl. Her har vi utvider tidligere fremskritt i DIB-dannelsesteknikker ved å foreslå en mikropipette basert teknikk, med muligheten til å kontrollere størrelsen på dråpene og bilaget grensesnitt, den kjemiske sammensetningen av hver dråpe, og spenningen ved grenseflaten gjennom dynamisk stimulering. Teknikken består av forankring vanndråper, som inneholder proteoliposomes, til tuppen av koaksielt motstridende glasskapillærer. Dråpene blir plassert i et bad av organisk løsningsmiddel, og når de bringes i kontakt med et lipidbilag dannes i grenseflaten.
De mikropipetter er festet til piezoelectric oscillatorer, slik at horisontal forskyvning av dråpene. Dynamisk komprimering av dråpene, resulterer i en økning av grenseflatespenningen i vannet oljeovergangen, og derfor en økning i dobbeltlaget spenning. To viktige aspekter skille denne metoden fra lignende og nylig publisert kontakt boble bilaget (CBB) teknikk 37. Ved å bruke den teknikk som presenteres her, er størrelsen av bilaget styres ved hjelp micromanipulators og dermed volumet av dråpene forblir konstant, i motsetning til i CBB metoden. I tillegg krever den CBB teknikk for trykkpumper, som ikke er nødvendig i metoden som presenteres i denne artikkelen å gjøre det enklere og enklere å bygge.
Vi er i stand til å innlemme og stimulere bakteriell MsCl for første gang, uten bruk av en patch pipette eller kjemiske modifikasjoner 38. Siden systemet letter dannelsen av robuste asymmetriske lipidbllag membraner, nærmere etterligner det lipid asymmetri i biologiske membraner. Dette gir oss muligheten til å studere effekter av kontrollert membran sammensetning eller asymmetri på aktiviteten til MsCl. I tillegg, gjennom bildebehandlingsteknikker, denne fremgangsmåten bidrar til å estimere spenningen på bilaget grensesnittet. Denne teknikken hjelper til å forstå prinsippene for interconversion mellom bulk og overflatekrefter i DIB, letter målinger av grunnleggende egenskapene membran, og bedrer forståelsen av MsCl respons til membran spenning.
Selv om denne metoden tar oss et skritt nærmere mot en biomolekylære stimuli-reagerende materiale og system til et annet fysiologisk miljø for å studere MsCl, er det begrensninger i systemet. Spenning i dette systemet ikke kan klemmes fast på grunn av tilstedeværelse av lipid-reservoaret i form av liposomer i hver dråpe, som har en tendens til å avlaste spenninger ved olje / vann-grenseflaten. Derfor, i dag mechanosensitive kanaler kan stimuleresi Dibs bare i en dynamisk regime. Tilstedeværelsen av luftbobler i systemet i betydelig grad påvirker den presisjon og reproduserbarhet av forsøkene. Luftbobler som er tilstede i hydrogelene kan medføre tap hvis elektrisk forbindelse.
Mens vi beskriver bruken av mikro pipette basert metode for stimulering av MsCl, kan den teknikk som brukes til å studere andre typer av MS-kanaler, og har potensiale til å bli brukt av forskere for å studere en rekke biomolekyler. For eksempel har lignende oppsett vært brukt i vårt laboratorium for å studere mechanoelectrical responsen for en kanal-fri dråpe grensesnitt dobbeltlag-membranen. Ulike proteiner kan bli rekonstruert og aktiveres ved hjelp av denne svært kontrollert oppsett, tar i betraktning at rekonstitusjonstiden miljøer i hver biomolekyl variere. Metoden som beskrives i denne artikkelen berører et betydelig bredere anvendelsespotensial som er bare begrenset til fantasien av forskeren.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapportert i denne publikasjonen er støttet av Air Force Office of Scientific Research Basic Initiative Grant FA9550-12-1-0464.
0.22 µm filter | Corning | 430624 | |
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) | Avanti Polar Lipids | 850356P | Purchased as lyophilized powder |
34-gauge microfil | World Precision Instruments | MF24G-5 | |
400 mL Centrifuge bottels | ThermoFisher | 3141 | Nalgene |
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz | Keysight Technologies | 33220A | |
Ampicillian | ThermoFisher | BP1760 | ACS Grade |
Avanti® Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610000 | |
Axio Scope.A1 | Carl Zeiss | – | |
AxioCam HSm | Carl Zeiss | – | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | – | |
BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator | Digi-Key | BK4017B-ND | |
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Dialysis tubing | 7 Spectra/Por | 132113 | MWCO 8000, 7.5 mm diameter |
DigiData 1440A system | Molecular Devices | – | |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
DPhPC | Avanti | 850356C | |
E-625 PZT Servo-Controller | Physik Instrumente | E-526 | |
FPLC System | Pharmacia Biotech | – | |
HCl | J.T. Baker | 9535-33 | |
Hexadecane, 99% | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | |
Homoginizer | Wheaton | 357426 | 15 mL |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Affymetrix | 17886 | |
IRGACURE® 2959 | IRGACURE® | 555047962 | |
Isopore Membrane Filters | EMD Millipore | VCTP02500 | |
Isopropyl Alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | ACS Grade |
KH2PO4 | Mallinckrodt | 7100 | ACS Grade |
Kimble-Chase | Kontes | 420401-1515 | Flex-Column |
LED-100 UV Spot Curing System | Electro-Lite, corp. | 81170 | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Manual Patch-Clamp Micromanipulators | Thorlabs | PCS-520N | |
MgCl2 | ThermoFisher | M33 | ACS Grade |
Microelectrode Holder | World Precision Instruments | MEH1S | |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
MOPS, minimum 99.5% titration | Sigma-Aldrich | M1254-100G | |
N2 Gas | Airgas | UN1066 | |
NaCl | EMD | SX0420-1 | ACS Grade |
Ni NTA agarose beads | Qiagen | 1000632 | |
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID | McMaster-Carr | 8486K545 | |
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator | Physik Instrumente | P-601 | |
PAGE gel | Bio-Rad | 456-9033 | |
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film | Parafilm® | PM999 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate | Polysciences, Inc. | 15178-100 | |
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk | Sterlitech Corporation | PCTB0425100 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405-500G | |
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves | VWR International | CA89-38-272 | |
Replacement Gasket 1.0mm | World Precision Instruments | GO1-100 | |
SDS | Sigma-Aldrich | L5750 | |
Silver wire | GoodFellow | 147-346-94 | Different diameters could be used depending on the application |
Sodium Azide | Affymetrix | 21610 | |
Test tubes | ThermoFisher | 14-961-27 | 12 x 130 mm |
Tryptone | ThermoFisher | BP1421 | |
Ultracal 30K | Millipore | UFC803024 | Amicore Ultra 30 MWCO |
VWR Light-Duty Tissue Wipers | VWR International | 82003-820 | |
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner | VWR International | 13089 | |
Water Purifier | Barnstead | D11931 | |
Yeast | ThermoFisher | BP1422 | |
β-octylglucopyranoside | Anatrace | O311S |