A Stroke Versatile modèle murin de Subcortical substance blanche pour l'étude de axonale Degeneration et blanc Matière Neurobiologie

Summary

Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.

Abstract

Stroke affectant les comptes de la substance blanche jusqu'à 25% des présentations d'AVC cliniques, se produit en silence à des taux qui peuvent être 5-10 fois supérieure, et contribue de manière significative au développement de la démence vasculaire. Peu de modèles de focale course de matière blanche existent et ce manque de modèles appropriés a entravé la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans la réponse des blessures et la réparation après ce type d'accident vasculaire cérébral. La principale limitation des autres modèles de course subcorticaux est qu'ils ne focalement restreignent pas l'infarctus à la matière blanche ou ont été principalement validées chez les espèces non-murins. Cela limite la capacité d'appliquer la grande variété d'outils de recherche murins pour étudier la neurobiologie du blanc coup de matière. Nous présentons ici une méthodologie pour la production fiable d'un accident vasculaire cérébral focal dans la matière blanche murin en utilisant une injection locale d'un inhibiteur de eNOS irréversible. Nous présentons également plusieurs variations sur le protocole général dont deux stéréotaxique uniquesvariations, traçage rétrograde neuronale, ainsi que l'étiquetage des tissus frais et dissection qui élargissent considérablement les applications potentielles de cette technique. Ces variations permettent de multiples approches pour analyser les effets neurobiologiques de cette forme commune et peu étudié d'accident vasculaire cérébral.

Introduction

Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US ¹. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia ^2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist ^4,5.

The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.

Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) ⁶ that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded ^7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.

The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) ⁹ with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 ¹⁰. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.

Protocol

L'utilisation d'animaux dans ce protocole a été effectué conformément aux procédures approuvées par l'Université de Californie à Los Angeles Animal Care et utilisation Comité. Remarque: Commencez par identifier la population murine cible. Dans des études antérieures, des souris de type sauvage uniquement mâles C57 / BL6 ont été utilisés, toutefois différentes souris transgéniques ou knock-out peuvent également être utilisés. Notez que les coordonnées stéréo…

Representative Results

En utilisant le modèle présenté, la substance blanche sous-jacente forelimb cortex sensorimoteur peut sûrement être ciblé. Ce modèle de course induite chimiquement produit axonale focal et la perte de myéline, astrocytosis et microgliose (Figure 1), comme cela est généralement vu dans Infarctus lacunaires humaines. En utilisant trois injections, un modèle cliniquement utile est établie avec une altération précoce sur les tâches à moteur forelimb 7</s…

Discussion

Un certain nombre de modèles antérieurs de l' AVC subcortical ont été décrites , y compris les injections focales de l' endothéline-1 dans la capsule interne, la substance blanche sous – corticale et striatum dans le ^6,15 rat ^12-14 et de la souris. Des modèles plus récents de petits coups focaux ont utilisé l' injection de micro – emboles de cholestérol dans l'artère carotide ¹⁶ et de l' occlusion photothrombotique d'un seul artériole pénétrant ^…

Materials

L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride	Calbiochem	400600-20MG
Isoflurane	Phoenix Pharmaceutical, Inc.	NDC 57319-559-06
Capillary tubes	World Precision Instruments	50-821-807
Picospritzer	Parker Instrumentation	Picospritzer II
Stereotactic setup	Kent Scientific	KSC51725
Pipette puller	KOPF	Model 720
Stereomicroscope SZ51	Olympus	88-124
Fine scissors	Fine Scientific Tools	14084-08
Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8547
Curved Forceps	Harvard Apparatus	PY2 72-8598
Blunt dissection tool	Fine Scientific Tools	10066-15
Drill	Dremel	8220-1/28
Drill bits	Fine Scientific Tools	19007-05
Vetbond	3M	1469SB
Marcaine	HOSPIRA	NDC 0409-1610-50
Trimethoprim-Sulfamethaxole	STI Pharmacy	NDC 54879-007-16
Fluororuby	Fluorochrome Inc	30mg
Paraformaldehyde	Fisher	O4042-500
Sucrose	Fisher	BP220-10
Cryostat	Leica CM3050 S	14047033518
Glass slides	Fisher	12-544-7
Fast Green	Sigma	F7252-5G
Dissection microscope	Nikon	SMZ1500
23 gauge butterfly needle	Fisher	14-840-35
10X Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14065056
1M HEPES-KOH, pH 7.4	Affymetrix	16924
D-Glucose	Sigma	G8270
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Cyclohexamide	Sigma	01810