الماء في مستحلب النفط: نظام جديد لتجميع البروتينات ملزم الكلوروفيل المياه القابلة للذوبان مع أصباغ مسعور
Summary
توضح هذه المخطوطة طريقة بسيطة والإنتاجية العالية لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور التي تقوم على مستحلبات الماء في الزيت. علينا أن نبرهن فعالية الأسلوب في تجميع الكلوروفيل الأم مع أربعة أنواع من المؤتلف للذوبان في الماء، الكلوروفيل ملزم البروتينات (WSCPs) من النباتات الكرنب وأعرب في E. القولونية.
Abstract
الكلوروفيل (CHLS) ويخضور جرثومي (BChls) هي العوامل المساعدة الأولية التي تنفذ حصاد ضوء الضوئي ونقل الإلكترون. وظائفها يعتمد بشكل كبير على منظمة معينة في إطار مجمعات البروتين multisubunit الغشاء كبيرة ومعقدة. من أجل فهم على المستوى الجزيئي كيف تسهل هذه المجمعات تحويل الطاقة الشمسية، فمن الضروري أن نفهم البروتين الصباغ، والتفاعلات الصباغ الصباغ، وتأثيرها على ديناميات متحمس. طريقة واحدة لكسب هذا الفهم هو من خلال بناء ودراسة المجمعات من CHLS مع البروتينات المؤتلف بسيطة للذوبان في الماء. ومع ذلك، والذي يتضمن CHLS دهون وBChls إلى بروتينات قابلة للذوبان في الماء أمر صعب. وعلاوة على ذلك، ليس هناك طريقة عامة، والتي يمكن أن تستخدم لتجميع البروتينات للذوبان في الماء مع أصباغ مسعور. هنا، علينا أن نظهر نظام الإنتاجية بسيط وارتفاع على أساس مستحلبات الماء في الزيت، والتي تمكن الحمارembly من البروتينات للذوبان في الماء مع CHLS مسعور. تم التحقق من صحة الطريقة الجديدة عن طريق تجميع الإصدارات المؤتلف من الكلوروفيل البروتين للذوبان في الماء ملزما من كرنبية النباتات (WSCP) مع كلوروفيل أ. ونحن لشرح التجمع الناجح لكلوروفيل لاستخدام لست] الخام من WSCP معربا عن E. خلية كولاي، والتي يمكن استخدامها لتطوير نظام شاشة الجيني للبروتينات ملزمة كلوروفيل جديدة للذوبان في الماء، وللدراسات التفاعلات كلوروفيل البروتين وعمليات التجميع.
Introduction
أصباغ مسعور مثل الكلوروفيل (CHLS)، يخضور جرثومي (BChls) والكاروتينات هي العوامل المساعدة الأولية في مراكز رد فعل الضوئي والبروتينات حصاد الخفيفة التي تنفذ نقل الإلكترون، والتقاط الطاقة الضوئية ونقلها. مراكز التفاعل ومعظم المجمعات حصاد ضوء ملزم كلوروفيل هي بروتينات الغشاء. البروتين Fenna-ماثيوز أولسون (FMO) من بكتيريا التمثيل الضوئي الأخضر الكبريت غير الاوكسجينية 1،2، والبروتين peridinin-كلوروفيل (PCP) من دينوفلاجيليت 3 أمثلة استثنائية من المياه القابلة للذوبان البروتينات حصاد الضوء. الكلوروفيل ملزم البروتينات للذوبان في الماء (WSCPs) من كرنبية، بطباطية، سرمقية والنباتات قطيفية 4، 5 ومثال فريد آخر، ولكن في المقابل لFMO وحزب المؤتمر الشعبي، وهذه هي ليست متورطة في ضوء حصاد ولا في أي من رد فعل الضوئي الأساسي وفيز على وجه الدقةوظائف siological غير واضحة 5-8 بعد. أدت بهم عالية تقارب ملزم كلوروفيل إلى وظيفة اقترح كحاملات عابرة من CHLS ومشتقاتها كلوروفيل 9،10. بدلا من ذلك، كان الافتراض بأن WSCP يلعب دورا في مسح CHLS في الخلايا التالفة ويحمي ضد يسببها كلوروفيل-الضرر photooxidative 7،11-13. وفي الآونة الأخيرة، اقترح أن ظائف WSCP كمانع البروتيني، ويلعب دورا خلال مقاومة عاشب كذلك ينظم موت الخلية أثناء التطور زهرة 14. وتنقسم WSCPs إلى فئتين الرئيسية وفقا لخصائصها بالفوتونات. الدرجة الأولى (الصف الأول، على سبيل المثال. من سرمق أبيض) قد تخضع photoconversion على الإضاءة. الدرجة الثانية WSCPs من النباتات الكرنب، التي لا تخضع photoconversion 5،10، وتنقسم الى مزيد من الدرجة الداخليين (على سبيل المثال، من OLERACEA الكرنب، Raphanus SATIVUS) وبنك الاستثمار الدولي (على سبيل المثال، من رشاد virginicum </eم>). تم حل بنية الطبقة بنك الاستثمار الدولي WSCP من رشاد virginicum من البلورات بالأشعة السينية في دقة 2.0 Å 8. أنه يكشف عن homotetramer متماثل التي مفارز البروتين تشكل نواة مسعور. كل فرعية تشد كلوروفيل واحد مما يؤدي الى ترتيب ضيق من أربعة CHLS معبأة بشكل وثيق داخل core.This بسيطة عن ترتيب كلوروفيل يجعل WSCPs نظام نموذجي يمكن أن تكون مفيدة لدراسة ملزمة وتجميع المجمعات كلوروفيل البروتين، وآثار CHLS المجاورة وبيئات البروتين على الخصائص الطيفية والإلكترونية للCHLS فرد. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن توفر نماذج لبناء البروتينات الاصطناعية ملزم كلوروفيل التي يمكن أن تستخدم لوحدات ضوء حصاد في أجهزة الضوئي الاصطناعي.
دراسات دقيقة من WSCPs مواطن ليست مجدية لأن المجمعات تنقيته من النباتات تحتوي دائما خليط غير متجانس من tetramers مع مجموعات مختلفة من كلوروفيل لوكلوروفيل ب 9. وبالتالي، لا بد من طريقة لتجميع WSCPs أعرب recombinantly مع CHLS في المختبر. والتحدي الذي يواجه هذا من قبل لا يذكر المياه للذوبان من CHLS مما يجعل من المستحيل لتجميع المجمع في المختبر ببساطة عن طريق خلط apoproteins للذوبان في الماء مع أصباغ في المحاليل المائية. في المختبر التجمع عن طريق خلط apoproteins مع الأغشية الثايلاكويد وقد تجلى 15، ولكن يقتصر هذا الأسلوب لالأصلي CHLS موجودة في ثايلاكويد. شميت وآخرون. تقارير عن تجميع عدة كلوروفيل وBChl المشتقات مع WSCP من القرنبيط (CaWSCP) بالإعراب عن recombinantly بروتين الموسومة الحامض الاميني في E. القولونية شل حركة وضعها على عمود ني تقارب وإدخال مشتقات شيلي بالفاعلات في المنظفات 11. إعادة بنجاح من WSCPs المؤتلف من أ. thaliana 6، وبراعم بروكسل (BoWSCP)، الفجل البري الياباني (RshWSCP) لوذكرت أيضا د فرجينيا pepperweed (LvWSCP) بطريقة مشابهة.
هنا، نقدم رواية، عام، طريقة مباشرة لتجميع CHLS مع WSCP التي لا تتطلب وضع علامات أو شل حركة البروتينات. وهي تعتمد على إعداد مستحلبات من المحاليل المائية على من apoproteins للذوبان في الماء في الزيوت المعدنية. وبالتالي مغلفة البروتينات في الماء في النفط (W / O) microdroplets مع سطح عالية جدا إلى نسبة حجم 16. ثم يتم حله العوامل المساعدة مسعور في مجال النفط وأدخلت بسهولة إلى قطرات من مرحلة النفط. نحن تقريرا عن استخدام طريقة لتجميع من عدة أنواع من apoproteins WSCP أعرب recombinantly في E. القولونية مع كلوروفيل أ. ونحن لشرح التجمع من المحللة الخام من البكتيريا overexpressing WSCP التي يمكن استخدامها كنظام فحص لتطوير البروتينات ملزمة كلوروفيل جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هدفنا هو تطوير نظام عام جديد لتجميع البروتينات للذوبان في الماء ملزم الكلوروفيل مع أصباغ مسعور. ومن هنا يظهر أن نظام إعادة جديد يقوم على W / O مستحلب هو النهج العام ثبت للعمل لتجميع apoproteins WSCP من براعم بروكسل والقنبيط والفجل الياباني وفرجينيا pepperweed أعرب recombinantly في E. ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف DN بدعم من الاتحاد الأوروبي FP7 مشاريع PEPDIODE (GA 256672) وREGPOT-2012-2013-1 (GA 316157)، ومنحة بحثية شخصية (رقم 268/10) من مؤسسة العلوم اسرائيل. نشكر البروفيسور شموئيل روبنشتاين، كلية الهندسة والعلوم التطبيقية، جامعة هارفارد، كامبردج، الولايات المتحدة الأمريكية لأخذ الصور المجهري متحد البؤر.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
References
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. 생화학. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
