배양 세포의 기능적 문제는 3 차원 배양 환경 16-21 -like 생체 내에서 배양함으로써 더욱 향상시킬 수있다. 이 논문은 생체 -like 포유 동물 조직 배양 용 중공 바이오 리액터 시스템의 셋업 및 동작을 설명한다.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
조직 배양은 100 년 이상 1,2- 이용 된 세포의 성장 및 / 또는 유지 보수를 위해 확립 된 기술이다. 연구 세포 반응 생체 편리 멀리 달리 불가능하지는 않지만 매우 어려울 것이다 실험을 허용 장점 도달했다 예컨대 유전자 조작 된 세포주의 생성 및 고 처리량 스크리닝 분석법 3 리포터 세포의 용도. 보다 최근에는 조직 배양은 시험관 모델의 생성과 재생 의학, 조직 공학 분야에 상승을 부여하고있다. 이러한 애플리케이션으로 동적 인 3 차원 (3D) 배양 시스템에 대한 관심이 크게 증가하고있다.
(3 차원 배양 용 기재 및 / 또는 방향 동적 흐름의 도입으로 여기에 정의) 3D 배양 방법 나은을 달성하기위한 중요한 생체 셀룰러 환경의 아키텍처를 요점을 되풀이더 많은 생리 같은 기능. 병 및 손상된 조직을 복구의 목적으로 이식 세포를 추출, 성장, 차별화 할 수있는 능력은 환자의 이익과 상업 기회를위한 거대한 잠재력을 가지고 연구하는 분야이다. 예를 들어자가 화상 치료 각화 세포 (4) 및 뇌졸중의 치료를위한 세포 기반 치료법의 사용의 사용 (도 5 참조). 마찬가지로, 시험 관내 모델에 대한 시장은 층화 의학 애플리케이션 약물 발견에 걸쳐있다. 조직 배양에서 협약 조직 배양 플라스크의 2 차원 (2D)의 표면에 부착 또는 고정 의존성 세포 유형의 성장이다. 현재 연구 속에서 금을 표준으로 인정하는 동안, 조직 공학 분야에서 최근의 관심은 현재 차원 조직 배양 환경이 전지 생산 6 필요한 스케일 업 부적절하다는 점을 강조하고있다.
자기편 세포 유형 scaffol에 대한(D)는 화학 성분과 기계적 성질 모두의 관점에서, 최종 용도에 따라 달라질 수있는 요구된다. 일부 시스템은 높은 내부 상 에멀젼 템플릿으로부터 형성된 다공성 매트릭스로 구성된 웰 플레이트 인서트 (7) 또는 종래의 2 차원 배양 기술에서 최소의 적응을 필요로하는 전기 방사 섬유 (8 참조) 지지체를 이용한다. 세포는 다양한 조성의 마이크로 담체에 접종 및 영양분과 신호 분자를 제공 교반 탱크에서 성장하고, 동적 잘 혼합 환경 (9)를 통해 폐기물 (대중 교통)을 멀리 운반 할 수 있습니다. 그러나, 이러한 시스템들은 생체 -like 환경에 제한이 더욱 향상 스케일 업하는 비용과 관련 될 수있다. 중공 섬유 생물 반응기 (HFBs)는 일반적으로 섬유 루멘을 통해 전달되는 다공질 섬유 및 미디어의 외측에 시드 셀 모듈에 고정 된 섬유로 구성되어 3 차원 배양 시스템 (1 검토0) (그림 1). HFBs는 섬유 원한다면 정의 전단 측면 포트를 통해 유체 유동을 통해 셀에 적용 할 수 있지만, 모세 혈관을 모방 동적 미디어 전달과 관련된 전단 응력에서 세포 차폐와 생체 -like 환경을 제공한다. 이 높은 세포 밀도가 11에 도달 할 수있는 우수한 대량 수송과 다양한 문화 시스템을 만듭니다. HFB 시스템은 고정 의존성 세포 유형의 유지에 적합하고 배양 랑게르한스 12 마우스 β-TC-3 인슐린 종 세포주 12 차 인간 간세포 13 자가골의 쥐 췌장 포함한 다양한 세포 사용 된 골수 단핵 세포는 14 Madin 다비 개 신장 세포 (MDCK) 15 카코 2 셀 (16)는 몇 이름을 지정합니다.
물질 전달 및 스케일 업 시스템의 이점에 더하여, 셀은 3 차원 TIS 재배고소 문화 시스템은 실험 단서에 형태와 생체 -like보다 더 반응 경향이있다. 예를 들어 2 차원 배양 (17)에 성장 세포에 비해 시판 폴리스티렌 골격에서 배양 할 때 차 간세포 해열 독성에 더 입방 형태 증가 가능성 시토크롬-P450 효소 활성의 큰 유도 및 감도 증가를 보여 쥐. 간암 세포주 인 HepG2 또한 알부민 생산 (18)을 증가시키고 2D 배양 된 세포 (19)에 비해 메토트렉세이트에 반응 -like 생체 내에서 더 많은 것을 보여주기 위해 표시되었습니다 같은 지지체를 사용하여. 차 인간 간세포가 지연 탈분화, 높은 사이토 크롬 P450-활동을 입증하고 관류 문화 시스템 (20)에서 테스트 4/5 화합물에 대한 허가를 증가했다. 인간 신경 줄기 세포 시판되는 폴리스티렌 지지체에서 배양 유래 신경 세포와 교세포가 높은 (활동 전위)과 낮은 freque을 모두 전시ncy (로컬 필드 전위) 더 신경 활성 반면 자발적인 활동은 2 차원 배양 된 세포 (21)에서 검출되었다. 카코이 세포는 증가 알칼리 포스 파타 아제, γ-glutamyltransferase 및 P-당 단백질 활성 및 단백질 16 F – 굴지 및 조나-1 occludens의 높은 발현에 의해 측정 2D 문화에 비해 HFB에 강화 된 차별화를 보여 주었다. 3D 세포 배양을 인용 서적의 수는 지난 10 년 (8 배 증가 성장 하였지만 장점에도 불구하고, 2 차원 조직 배양 플라스크면 이외의 시스템에서의 셀의 루틴 배양 여전히 많은 실험실에서 실시되지 않는다. 소스 '3D 문화')와 프로브 도구 PubMed의 '연도 별 결과'.
이 논문은 포유 동물 세포 배양 용 HFB 시스템의 설치 및 작동 조건을 설명하고, 간암 세포주 인 HepG2 / C3A 배양에서의 유틸리티를 보여준다. 이 방법의 목적은 배양의 세포 인충분히 단순 유지보다 생체 -like 문화 시스템은 3D 문화 시스템을 처음 사용하는 사람들에게이 의무 확인합니다. 애플리케이션에 HFBs을 사용 뒤에 근거 간 모델의 예측은 HFB 환경 (22) 내에서 사인 곡선 간을 모방 이론적으로 가능하다는 것이다 개선되는, 여기에서 설명한다. 이것은 다른 문화 시스템과 현재 가능하지 않습니다.
이 논문은 포유 동물 세포 배양 용 중공 섬유 생물 반응기 (HFB) 시스템의 셋업 및 동작을 설명 및 유틸리티는 간세포 세포주 인 HepG2 / C3A 증식에서 입증된다. 이 시스템은 표준 보육과 셋업의 선반에 맞게 설계되어 무균 기술을 잘 알고있는 유능한 세포 생물 학자에 의해 수행 될 수있을만큼 간단하다.
여기에 설명 된 조사 시스템에 사용되는 섬유는 비 – 생분해 성 중합체를 사용 독점 (회전)을 주조 전상 스핀에 의해 집에서 제조된다. 예를 들어, 세포 배양 물에 적합한 두 생분해 성 및 비 생분해 성 재료의 다양한 방사하여 섬유를 만드는 것이 가능하다; 폴리 카프로 락톤 (PCL) 27, 폴리 -L- 락 티드 산 (PLLA) (28), 폴리 (락트산 – 코 – 글리콜 산) (PLGA) (29), 폴리 술폰 (PSU) 12 폴리 에테르 에테르 케톤 (PEEK) 13. 각각 다른 속성 A가 들어ND 시스템의 요구에 따라 선택되어야한다. 멸균 공정에 사용 된 에탄올로 사용될 섬유의 적합성을 확인한다. PLGA 에탄올 같은 항생제 / 항진균제 용액 (25)과 같은 대체 요법을 필요로 가소 화하는 것으로 알려져있다.
여기에 사용되는 유리 모듈의 크기는 현재 연구의 필요성에 기초하여 선택 하였다. 다른 크기는 임의의 평판 유리 부는 회사에 의해 제조 될 수있다. 모듈 크기를 고려 모듈의 섬유 가능성 유량의 개수에 연결된 셀들의 수이다. 더 많은 셀은 높은 유량 생물 반응기의 유출 단부에서 바람직한 배양 조건을 유지하기 위해서 필요한 것이다 모듈있다. 이 모듈 투과 미디어 조건의 모니터링 요구 될 수있는 몇 가지 포인트와 시행 착오 등의 한계에 도달 할 것이다. 수학적 모델링에 필요한 모듈 DIMEN에 몇 가지 통찰력을 제공 할 수있다sions 및 유속 22.
여기에 사용되는 장치의 치수를 인큐베이터 선반에 맞도록 설계된다. 튜브의 길이는 셋업 및 동작을 허용하도록 구성 충분한 이동을 허용하는 동안 커넥터 사이에 도달하는 데 필요한 길이에 의해 결정된다. 시간 경과 샘플링이 필요한 경우에는, 모듈의 미디어 환경을 모니터링, 예를 들어 다음 주입구 잔류 물에 첨가 될 수있는 투과 및이를 용이하게하기 위해 선을 투과.
모든 세포 배양 시스템을위한 필수 조건이 살아 있고 성장하는 대부분의 경우에 세포를 유지하는 것이다. 3 차원 배양 시스템에서 자란 세포 표현형 -like 생체 내에서 자세히 보여주는 연구에 비추어 또한 밀접 세포에 의해 발생하는 생체 내 환경을 모방 한 환경을 제공하기 위해 중요한 것 같다. 이 마지막 점은 종종 문화 시스템이 제공하는 편의 찬성 차원 세포 배양에서 무시됩니다. 티그 섬유의 루멘을 통해 세포에 영양분을 제공하여 생체 내 모세 혈관 망에서 모방 HFB. 노폐물은 동적 흐름에 의해 시스템으로부터 제거된다. 이는 이들 세포를 배양하기위한 차원 조직 배양 플라스틱에 비해이 시스템에게 더 나은 선택을하고, 세포 배양과 밀접하게 간세포 볼 생체 내 환경을 모방 한 대한 생체 -like 시스템을 만듭니다. 이는 세포가 분비하는 사실에 의해 뒷받침되는 15 배 차원 조직 배양 플라스틱에 성장 된 것과 비교하여 HFB 배양 계에서의 알부민의 양이 중요한 간 기능.
HFB 시스템은 대부분의 경우, 모든 고정 의존성 세포 유형에 적합 동안 제약 산업 기능 배양보다 생체 -like 신약 개발에 사용하기위한 간세포 할 수 있도록 실제 필요가 있기 때문에,이 예는 여기에서 간세포위한 및 체외 지원 bioartificial 간 장치에간 장애 환자. 기능적인 셀에 대한 필요성은 재생 의료 분야는 번역 작업 단계로 진입 특히, 이러한 실시 예를 넘어 연장된다. 보다 생체 -like 문화 환경의 장점은 간과해서는 안된다.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |