We developed a protocol that is fast, sensitive and reproducible for pathogen gene expression profiling during an infection.
对于大多数哺乳动物病原体,基因表达谱研究已经通过技术困难限于准确地从感染组织量化病原体基因转录。病原RNA构成从被感染的组织样本中分离出的总RNA的一小部分。这两种芯片和RNAseq技术在产生困难可靠的读取为弱表达病原体的基因。突变的病原体菌株具有降低体内扩散构成了更大的挑战。在这里,我们描述了一种在体内基因表达谱协议,这是非常快速的,极其敏感的和高重现性的。我们在我们的血行播散性念珠菌的鼠模型的真菌病原体白色念珠菌的调查过程中开发了这个协议。使用这个协议,我们已经证明动态调节C.时程肾脏感染期间白色念珠菌基因的表达,并发现了意想不到的功能基因表达反应抗真菌药物治疗的体内 。
基因表达的动态保存有关细胞如何响应环境变化的重要信息。在一个微生物感染的情况下,基因表达数据可提供有关如何病原体适应于感染环境造成损害到主机临床相关的见解。在过去的二十年里, 无论是在体外和体内基因表达研究已经产生大量的数据,并奠定了基础,了解感染生物学1-3。然而,目前的分析技术,包括芯片和RNAseq,是不是最佳的病原体基因表达的感染过程中剖析。宿主RNA构成从感染的组织样品中分离的总RNA的压倒性部(通常> 99%)。主机RNA有助于对芯片高背景,而占主导地位序列从RNAseq读取。从感染组织病原体细胞分离,在理论上,可以帮助以富集病原体RNA,但它提出了另外人的问题:它需要大量的感染组织;该过程可能是乏味;而且最重要的,所以很难在冗长的过程,以节省天然状态或RNA的完整性。为了产生过程中真正的感染病原基因的表达更全面,更准确的数据,我们着手开发一个协议,允许少数RNA分子的可靠和具有成本效益的量化在混合RNA群。
NanoString NCounter酒店是最近开发的平台使用数字条形码探针对4,5,该平台具有灵敏度水平比得上QRT-PCR的,但不要求酶促扩增,使基因表达的直接复用的测量。该技术并不全基因组,它可以检测在每个测定高达800种不同的基因。因此,关键是要选择信息的基因作为探针进行性能分析。在这里,我们使用基因表达分析的主要嗡嗡声的研究一个病原体,白色念珠菌,在侵入性感染,例如,以证明:1)的实验程序(协议)的技术细节,2)该方法的灵敏度,再现性和动态范围(代表性的结果),和3)重要考虑用于设计和执行基于这个协议(讨论)的实验。该协议可以很容易地适用于各种病原体,并已在许多感染模型6-9得到成功应用。
该协议开发,优化感染使用nanoString NCounter酒店平台的微生物的转录谱。整个过程,从组织收集到的表达数据,需要不到48小时。动手时间约4小时的12个样品。在这个协议中的一个关键的变量是缓冲RLT的加入到组织上的第一步骤的量。太多缓冲器会稀释匀浆,并导致降低的RNA浓度,而过少缓冲器可能导致苯酚氯仿提取步骤后形成粘性凝胶的,离开RNA回收无水相。缓冲RLT为小鼠组织(假设典型大小)的经验确定最佳体积为:肾(1.2毫升),舌(1.0毫升)和肺(2.0毫升)中。对于病原微生物,特别是这些丝状的形式不断壮大,珠跳动一步,有助于破开厚厚的细胞壁充分释放细胞内容物。在洗脱工序中,为了提高最终核糖核酸浓度,在第一轮洗脱液可加回到柱中,洗脱第二次。大约总的组织的RNA的100微克可以从一个RNeasy旋转柱(〜2微克/微升×50微升)进行回收。如果需要较大的RNA量,第二制备可以从剩余的组织匀浆进行。直到RNA浓度进行了测量不处置剩余的匀浆,以防万一。
根据感染模型中,接种量和病原体菌株,病原体RNA的总的组织的RNA的百分比从0%-2%之间,典型地落在0.05%-0.5%的范围内。例如,10微克从 C总组织的RNA的白色念珠菌感染的肾能产生原始计数等于10毫微克纯C的白色念珠菌 RNA的体外培养(10毫微克/ 10微克= 0.1%)。由于病原RNA的总的组织的RNA的百分比在宽范围内变化,它是很难知道pathoge的量ÑRNA的总RNA的给定量。为了避免浪费代码集(250个基因×192反应,每次反应的费用是约$ 200)上与低于检测水平病原体RNA样品,的RNA质量控制步骤可被执行,以确定各样品中的病原体RNA水平。这可以通过Q-RT-PCR或含几看家基因的小的代码集来完成。
用病原体的基因正常化是表达谱前的关键步骤可以在不同样本间进行比较。有三个用于标准化的常用方法。 1.使用总计数从代码集所有基因。 2.用一个或几个“看家”基因。 3.使用几何平均值( 第 N N个数的乘积的根)的高表达基因。对于一个大的代码集(> 100个基因),含随机选择探针,采用总计数正常化可以是一个很好的选择,因为大量不相关的基因可能信仰的总计数充分体现RNA的输入量。对于一个小代码集(<100基因)含有探针集中在一个特定的处理(例如菌丝生长,考虑到菌丝生长基因往往被共调节的),选择一个或几个看家基因作为对照用于标准化是必不可少的。 TDH3,一个健壮表达代谢基因,曾和控制的许多实验。第三种方法是方法1和2的混合体,重点用于从高表达基因相等的贡献。
虽然NCounter酒店平台不全基因组,它允许表达水平的定量为高达800个基因在单次分析。因此,选择最能提供信息的基因分析是对纹的成功至关重要。两种方法来选择用于探针已被使用。第一种方法是“基础知识”。已出版的表达和功能的数据的信息被编译以筛选基因是潜在感兴趣的当前研究,如对环境的反应基因6-9。这种方法使体内的分析数据,许多现有的数据集,从而提供上下文数据诠释容易比较。第二种方法是“基于探索”。 A类基因在微生物基因组中,如指定转录因子,激酶或细胞壁蛋白的所有基因的被选择为探针。这种方法允许识别基于所述体内分析数据6新颖毒力因子和发现的新调节的关系。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由美国国立卫生研究院资助R21 DE023311(APM),R56 AI111836(APM&SGF),R01 AI054928(SGF),和R01 DE017088(SGF)的部分资助。
gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
Phenol:ChCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |