Fekal Glukokortikoid Analizi: Tek tırnaklılarda in Non-invaziv Adrenal İzleme
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
yöntem tarif amaçları adrenal aktivite non-invaziv bir değerlendirme sağlamak amacıyla at dışkısı kortikosteron konsantrasyonları analiz etmek. hipotalamus-hipofiz-adrenal (HPA) eksen aktivitesinin ölçülmesi esir ve yerli türler hem potansiyel caydırıcı durumlara tepki incelemek için kabul edilmiş bir yaklaşımdır. Referans tekniği ve en yaygın olarak kullanılan yöntem, ancak bu tür dışkı analizi gibi alternatif yöntemler bilgilerini kadar tür izleme olanağı kan örneği kendisinin neden olduğu stres üstesinden gelmek ve sağlamak amacıyla geliştirilmiştir kan plazması 1 'in kullanımı olup.
caydırıcı bir durum sırasında, fizyolojik homeostasis bozulur. ön hipofiz bezi üzerinde hareket eder ve adrenokortikotropik hormon (ACTH) salınımını uyarır salgılatıcı hormon (CRH) kortikotropin beyin sürümlerde hipotalamus. ACTH kan dolaşımına girer ve türünden salgılaması için adrenal korteksi uyarırs, belirli glukokortikoidler (GC). Glukokortikoidler yakından oldukça tutarlı nedenle genellikle diğer stres bağlantılı hormonların üzerinde 2 tercih ölçülen tüm enerji artan devletler üretilen daha stresli olaylarla bağlantılıdır. Glukokortikoidler atların birçok adaptif etkileri sorumludur. Enerji hızlı yağlı asitler ve glukoz şeklinde vücuda depolama sitelerinden mobilize, oksijen alımı sensör fonksiyonu 3 geliştirilmiş ve kan akımı hareket 4 için gerekli olmayan alanlara azaltılır, artar. Yanı sıra bir başa çıkma mekanizması olarak hareket olarak, Glukokortikoid stres kaynaklı artış da sonraki stresör 5 için hayvan hazırlamak için yardımcı olabilir.
Hormon plazmadaki düzeyleri ve tükürük değerlendirilmesi gaita önlemler hormon metabolik son ürünü metabolitleri ölçmek, ancak gerçek dolaşan hormonu ölçüm içerir. Sirkülasyon steroid l katabolize edilenonlar bağırsak parça 6 içinde bakteri florasının enzimatik faaliyetleri kolaylaştırdı ileri değişikliklere uğrarlar safra için atılımı önce Iver. Bu nedenle, kan glukokortikoid yönelik bağışıklık dışkı glukokortikoid metabolitlerin 7 analizi için uygun olmayabilir.
Dışkı toplanması, at için bir rahatsızlık ile gerçekleştirilebilir gibi, kortikosteron için dışkı analizi, koşullar, bir dizi HPA etkinliğini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Atların dışkı içinde yükseltilmiş kortikosteron ameliyat sonrası tedavisi için veteriner hekimliğinde 8 boyunca ve kısıtlayıcı yuva 9 da dahil olmak üzere, potansiyel olarak caydırıcı durumlara cevap olarak bildirilmiştir. Fekal örnekleme zamanla toplanmış glukokortikoid düzeyi ziyade uzun vadeli, kronik veya mevsimsel desenleri 10 izlenmesi için uygun hale plazma ve tükürük tarafından sunulan zaman örnekleme noktasını yansıtır. Nedeniyle non-invaziv içinYöntemin niteliği, numuneler yakalama veya bağlama 11 gerek kalmadan bir birey için, art arda toplanabilir. Bir numune alma protokolü planlama Ancak, türe özgü bağırsaktan geçiş süresi dikkate alınmalıdır. Atlarda, bağırsaktan geçiş süresi bu • durumda, böbrek üstü tepkisi ve daha sonra kortikosteron metabolitleri HPA ekseninin ilk aktivasyon bir gün sonra dışkı ile saptanabilir yaklaşık 18 saat 12'dir.
Non-invaziv immunoassay teknikleri kullanılarak zaman araştırılan türler için dikkatli bir doğrulama 13 esastır. Buna ek olarak, hormon metabolit boşaltım cinsiyet farkları nedeniyle metabolizma hızı ve fareler 14. ve tavuk 15 de dahil olmak üzere çeşitli türlerin atılır kortikosteron metaboliti türü farklılıkları muhtemelen bildirilmiştir. th ayrıntılı gibi deney erkek ve dişi, evcil atlar uygulamalarında kullanmak için geçerli olan bu yöntemin bir parçası olarak, bu nedenle önemlie protokolü. Cinsiyetler arasındaki hormon metabolizmasında Bu fark ele alınması ve tahlil doğrulama parçası olarak dahil nadiren edilir henüz veri kalitesi için sonuçları vardır.
Bu non-invaziv yöntem yerli atlar adrenal aktivitenin uzun süreli değerlendirmesini sağlar. protokol ayrıntıları testin geçerliliği ve tahlil tekniği kendisi hem de.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dışkı kortikosteron analizi atlarda adrenal aktivitenin uzun süreli desen değerlendirmek için bir araç sağlar. Yöntemin non-invaziv doğa tükürük ve plazma analizi 9 olmak üzere adrenal aktivitesini değerlendirmek için kullanılan diğer örnekleme yöntemleri karıştırıcı etkilerini ortadan kaldırmaktadır. Buna ek olarak teknik ücretsiz değişen atları okuyan eğer net bir non-invaziv bir avantaja sahiptir.
Bu yöntemle ve uygun kullanımıyla ilgili gör?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?. Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
- Nelson, R. J. . An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
