We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.
Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.
Многоклеточные 3D сфероидов были известны как модели опухоли на протяжении десятилетий, однако это только недавно, что они пришли в более общем использовании в качестве модели в пробирке для многих солидных раков. Они все чаще используются в высокой пропускной экранов обнаружения наркотиков в качестве промежуточного между сложный, дорогостоящий и трудоемкий в моделях естественных условиях и простой, низкая стоимость 2D модели монослоя 1-6. Исследования, проведенные в 2D культуре часто не в состоянии быть воспроизведены в естественных условиях. Сфероид модели многих видов рака способны имитировать характеристики роста, лекарственной чувствительности, проникновение наркотиков, межклеточных взаимодействий, ограниченное наличие кислорода и питательных веществ и развития некроза, что видели в естественных условиях в твердых опухолях 6-11. Сфероидов разработать некротический стержень, покоя или G1 арестованного область, окружающую сердцевину, и пролиферирующих клеток на периферии сфероида 7. Развитие этих регионахможет изменяться в зависимости от плотности клеток, пролиферации и скоростью размера сфероида 12. Она была выдвинута гипотеза, что сотовый неоднородность видел в этих различных субрегионов может способствовать рака сопротивления терапии 13,14. Поэтому умение анализировать клетки в этих регионах отдельно важно ответов наркотиков опухолевых понимание.
Система показатель клеточного цикла флуоресценции убиквитинирования (Fucci) основан на красный (Kusabira Orange – нокаутом) и зеленый (Green Адзами – А.Г.) флуоресцентного мечения Cdt1 и geminin, которые деградировали в разных фазах клеточного цикла 15. Таким образом, клеточные ядра появляются красные в G1, желтый в начале S и зеленый в S / G2 / M фазе. Здесь мы опишем два дополнительных методов и с помощью Fucci определить клеточный цикл, вместе с использованием обработки изображений или диффузионного потока красителя цитометрии для определения, находятся ли клетки в G1 задержаны центра или внешней proliferatinг кольцо, а расстояние отдельных клеток от края сфероида. Эти методы были разработаны в нашей предыдущей публикации, где мы показали, что клетки меланомы в гипоксических регионов в центре сфероида и / или в присутствии целенаправленной терапии могут оставаться в G1 сердца в течение длительных периодов времени, и может повторно введите клеточного цикла, когда более благоприятные условия возникают 7.
Полу-автоматизированный анализ изображений определили сфероида внутренний G1 арестован регион и пролиферирующих внешние слои. Этот метод может быть использован на живых сфероидов с помощью оптического сечение, или в фиксированных участках сфероида, чтобы определить изменения в не то…
The authors have nothing to disclose.
We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
vibratome | Technical Products International, Inc | ||
coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
collagenase | Sigma | C5138 | |
confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
Cell strainer 70 um | In Vitro | FAL352350 | |
Round bottom 5 mL tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
Round bottom 5 mL tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |