Eine Strategie zur Validierung der Rolle der Kallose-vermittelten Plasmodesmal Gating im Tropic Antwort

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Gene Screening plasmodesmal Permeabilität und damit Auxin Gradienten während tropischen Reaktion zu steuern. Dies beinhaltet die Messung des Grades der Tropic Reaktion in Hypokotyl von Arabidopsis thaliana und plasmodesmal Permeabilität von 8-Hydroxypyren-1,3,6-trisulfonsäure (HPTS) Laden und schließlich Kallose- Ebene Beurteilung zu überprüfen.

Abstract

Das Pflanzenhormon Auxin spielt eine wichtige Rolle in vielen Wachstums- und Entwicklungsprozessen, einschließlich tropische Reaktionen auf Licht und Schwerkraft. Die Einrichtung eines Auxin Gradient ist ein Schlüsselereignis zu phototropism und Gravitropismus führt. Zuvor wurde polare Auxin-Transport (PAT) gezeigt ein Auxin Gradienten in verschiedenen zellulären Domänen von Pflanzen zu schaffen. Allerdings Han et al. Haben kürzlich gezeigt , dass für eine ordnungsgemäße Auxin Gradienten Bildung, plasmodesmal Kallose-vermittelte symplasmic Konnektivität zwischen den benachbarten Zellen ist auch ein kritischer Faktor. In diesem Manuskript, auf die Strategie, die Rolle bestimmter Gene aufzuklären, die phototropism und Gravitropismus durch Veränderung der symplasmic Konnektivität durch Modulation plasmodesmal Kallose- Synthese beeinflussen können, wird diskutiert. Der erste Schritt ist zusammen mit dem Wildtyp abweichenden tropischen Antworten von 3 Tage alten etiolated Sämlinge von Mutanten oder Überexpression Linien eines Gens zu screenen. Diese vorläufige Screeningkann dazu führen, symplasmic Verbindung zur Identifizierung einer Reihe von Genen in PAT funktionieren oder zu steuern. Das zweite Screening beinhaltet die Sortierung von Kandidaten, die durch Beeinflussung symplasmic Konnektivität veränderten tropischen Antworten zeigen. Um solche Kandidaten, die Bewegung eines symplasmic Tracer und die Ablagerung von plasmodesmal Callose adressieren wurden untersucht. Diese Strategie wäre nützlich, neue Kandidaten-Gene zu untersuchen, die symplasmic Konnektivität direkt oder indirekt bei Tropic Reaktionen und andere Entwicklungsprozesse regulieren kann.

Introduction

Pflanzen, wie sessile Lebewesen haben ein hochentwickeltes Netz von Zell-zu-Zell-Signal entwickelt, um verschiedene Umweltstimuli ansprechen. Tropic Reaktionen sind eines der Phänomene, bei dem Pflanzen auf Umweltreize reagieren. Pflanzen zeigen zwei Haupt tropischen Antworten, Phototropismus und Gravitropismus. Photosynthetic Pflanzen biegen in Richtung der Lichtquelle durch Phototropismus maximale Energie zu ernten. In ähnlicher Weise macht Gravitropismus die Pflanzen in Richtung des Schwerpunkts zu wachsen. Der grundlegende Mechanismus für solche tropischen Reaktionen führen beinhaltet asymmetrische Gradienten Bildung der Phytohormone Auxin ^1. Der Akt des lokalen Auxin Gradienten Bildung ist gut charakterisiert; die Gene , die an diesem Mechanismus beteiligt sind , bieten einen Fahrplan für die Hormonwirkung ^2-8. Die spezifische Position der Auxin Efflux Träger, wie PIN-FORMED (PIN) und P-Glykoproteine, führt die Bewegung von Auxin aus dem Cytoplasma in den Zellwand von Donorzellen ^9,10. Furthermore, durch die aktive H ⁺ / IAA Symport Aktivität von Auxin Einstrom Träger wie AUX1 / LAX Familienproteine, Auxin wird schließlich zu den benachbarten Empfängerzellen ^2,11,12 geliefert. Diese gerichtete Bewegung von Auxin als polare Auxin-Transport (PAT) bekannt. PAT führt zu einer differentiellen Auxin Verteilung während der verschiedenen Entwicklungsstadien und als Reaktion auf unterschiedliche Umweltreize ^13,14. Darüber hinaus führt die Unterbrechung der Lokalisierung oder Expression von beliebigen dieser Auxin Einströmen oder Ausströmen Träger schwerer Veränderung in PAT, die eine Unterbrechung des Auxin-Gradienten bewirkt, zu Entwicklungsstörungen führen. Vor kurzem Han et al. berichtet , dass plasmodesmal Regelung auch notwendig ist , ¹⁵ die Auxin – Gradienten zu halten. Bis heute, mehr als 30 plasmodesmal Proteine ​​wurden ¹⁶ identifiziert. Unter diesen Proteinen als ein Schlüsselenzym für die Synthese bei Callose plasmodesmata (PD), und somit spielt eine wichtige Rolle in maint berichtet AtGSL8 wurdeaining die PD Größe Ausschlussgrenze (SEL). Unterdrückte AtGSL8 Expression führte zu einer verzerrten Muster Auxin Gradienten zu keinem tropischen Reaktion im Gegensatz zu Wildtyp – Sämlinge ¹⁵ führt.

In diesem Manuskript, zu Methoden, um neue Kandidaten-Gene erforschen, die bei Parkinson-Regulation beteiligt sind, zur Verfügung gestellt. AtGSL8 wurde als Modell-Protein verwendet, um diese Methoden zu testen, da es ein Schlüsselenzym trägt Callose Biosynthese PD. Aufgrund der Sämlings-Letalität gsl8 ¹⁷ Mutanten knock-out, Dexamethason (Dex) -induzierbaren RNAi – Linien wurden in Übereinstimmung mit einem zuvor veröffentlichten Bericht ¹⁵ verwendet. Die Strategie hier kann vorgesehen sein, angepasst Gene zu suchen, die in Hypokotyls Tropic Antwort von PD SEL gesteuert beteiligt sind.

Protocol

1. Screening von Mutanten mit Altered Phototrope und Gravitrope Antworten Bereiten Sie 1x Murashige und Skoog (MS) Medium, pH 5,7, mit 0,8% Agar einen Tag vor dem Experiment. In 800 ml doppelt destilliertem Wasser in einen 2 l-Erlenmeyerkolben und rühren mit einem Magnetstab. In 4,4 g MS Salz in den Erlenmeyerkolben. Mit 0,5 g 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) und rühren, bis alle Salze vollständig gelöst sind. Der pH-Wert des Mediums auf 5,7 mit 1 M KOH. </l…

Representative Results

In der aktuellen Setup, Dexamethason (DEX) -induzierbaren RNAi Linien AtGSL8 [im Folgenden dsGSL8 (+ dex / -dex)] verwendet wurden, als homozygote gsl8 T-DNA Insertionsmutanten letalen 18 Sämling. Drei Tage alten etiolated Sämlinge von dsGSL8 und Wildtyp – Sämlinge mit ± dex wurden phototropes und gravitropen Reizen ausgesetzt. Wir fanden , dass dsGSL8 (+ dex) Sämlinge 15 in phototropism und Gravitropismus defekt war…

Discussion

In diesem Manuskript, zu screenen, eine Strategie Mutante / Überexpression Linien, die aufgrund veränderter PD phototropes und gravitropen Antworten defekt sind Kallose- und somit PD SEL im Detail beschrieben wird. PD Callose Synthese und Abbau wird hauptsächlich durch Callose Synthasen und β-1,3-Glucanasen erreicht, aber Regulation dieser Enzyme wird von vielen Faktoren stromaufwärts gesteuert. Um solche vorgelagerten Faktoren oder Kandidaten zu suchen, die bei Parkinson-Verordnung unmittelbar beteiligt sind, habe…

Materials

HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 mL glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri Dish (35×10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 x 125 x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds