トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略
Summary
この記事では、指向性応答の間にplasmodesmal透過性、ひいてはオーキシン勾配を制御する遺伝子をスクリーニングするための方法を説明します。これは、胚軸における向性応答の程度の測定を含みます シロイヌナズナおよび8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸（HPTS）ロードし、最終的にカロースレベルの評価によりplasmodesmal透過性を確認します。
Abstract
植物ホルモンのオーキシンは、光と重力向性応答を含む多くの成長と発達の過程で重要な役割を果たしています。オーキシン勾配の確立は光屈性と重力屈性につながる重要なイベントです。以前に、極性オーキシン輸送（PAT）は、植物の異なる細胞ドメインでオーキシン勾配を確立することが示されました。しかし、Han らは 、最近、適切なオーキシン勾配形成のために、隣接するセル間plasmodesmalカロース媒介symplasmic接続性も重要な要素であることを実証しました。本稿では、plasmodesmalカロース合成を調節することを通じてsymplasmic接続を変更することによって光屈性と重力屈性に影響を与える可能性があり、特定の遺伝子の役割を解明するための戦略が議論されています。最初のステップは、野生型と一緒に突然変異体または遺伝子の過剰発現株の3日齢の黄化苗から異常な熱帯応答をスクリーニングすることです。この予備スクリーニングPATで機能やsymplasmicの接続を制御する遺伝子の範囲の同定につながることができます。二次スクリーニングはsymplasmic接続に影響することにより改変された指向性応答を示す候補の選別を伴います。このような候補者に対処するために、symplasmicトレーサーの動きとplasmodesmalカロースの沈着を調べました。この戦略は、熱帯応答や他の発達プロセスの間に直接的または間接的にsymplasmic接続性を調節することができる新たな候補遺伝子を探索するのに有用であろう。
Introduction
植物は、固着生命体として、様々な環境刺激に対処するために、細胞から細胞へのシグナル伝達の高度に洗練されたネットワークを開発しました。トロピック応答は、植物が環境刺激に応答することにより、現象の一つです。植物は、主に2つの指向性応答、光屈性と重力屈性を示しています。光合成植物は、最大エネルギーを収穫する光屈性により光源に向かって曲がります。同様に、重力屈性は、植物が重力の中心に向かって成長することができます。このような熱帯の応答につながる基本的なメカニズムは、植物ホルモンのオーキシン1の非対称勾配の形成を伴います。地元のオーキシン勾配形成の行為は十分に特徴付けされています。このメカニズムに関与する遺伝子は、ホルモン作用2-8のためのロードマップを提供します。オーキシン例えばPIN形成（PIN）として排出される担体、およびP糖タンパク質の特定の位置は、ドナー細胞9,10の細胞壁への細胞質からオーキシンの移動を実行します。 Furthermore、このようなAUX1 / LAXファミリータンパク質としてオーキシン流入キャリアのアクティブH + / IAA共輸送活性により、オーキシンは、最終的には、隣接するレシーバセル2,11,12に配信されます。オーキシンのこの方向の動きは、極性オーキシン輸送（PAT）として知られています。 PATは、種々の発生段階の間に、別の環境刺激13,14に応答して、差動オーキシン分布につながります。また、これらのオーキシンの流入や流出担体のいずれかの局在または発現の破壊は、発達障害につながる、オーキシン勾配の破壊を引き起こすPATの深刻な変化をもたらします。近年、Han ら 。 plasmodesmal規制はオーキシン勾配15を維持するためにも必要であることを報告しました。今日まで、30以上のplasmodesmalタンパク質16が同定されています。これらのタンパク質のうち、AtGSL8は原形質連絡にカロース合成の鍵酵素（PD）として報告されているので、のmaintで重要な役割を果たしていますPDサイズ排除限界（SEL）をaining。抑制AtGSL8発現は、野生型苗15とは対照的に、無指向性応答につながる歪んだオーキシン勾配パターンが得られました。
本稿では、PDの調節に関与する新たな候補遺伝子を探索するための方法が提供されます。これはPDのカロース生合成に寄与する重要な酵素であるようAtGSL8は、これらの方法を試験するためのモデルタンパク質として使用しました。ノックアウトgsl8変異体17の苗-致死に、デキサメタゾン（DEX）誘導性のRNAi線は以前に発表された報告書15に従って使用しました。ここで提供される戦略は、PD SELによって制御される胚軸指向性応答に関与する遺伝子をスクリーニングするために適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、戦略が原因したがって、PD SELが詳細に記載されている変更されたPDのカロースと、への屈光性や重力屈性応答の欠陥がある変異型/過剰発現株をスクリーニングします。 PDのカロース合成および分解は、主にカロース合成酵素とβ-1,3-グルカナーゼにより達成されるが、これらの酵素の調節は、多くの上流の因子によって制御されます。このような上流因子または直接PDの調節に関与?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究では、韓国の国立研究財団（NRF-2015R1A2A1A10053576）によってサポートされていました、そして次世代BioGreen 21プログラムからの助成金によって（SSACは、PJ01137901を付与）、農村振興庁、韓国。 RK、WS、ABBとDKは脳韓国21・プラス・プログラム（BK21 +）でサポートされていました。
Materials
| HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
| Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
| 100 mL glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
| Petri Dish (35×10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
| Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
| MS medium plates 125 x 125 x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
| Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
| (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
| Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
| 1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
| 1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
| Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
| Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
| Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
| Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
| Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |
References
- Went, F. W., Thimann, K. V., Bard, P. Phytohormones. Experimental biology monographs. , 204 (1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
- Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
- Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
- Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
- Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
- Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
- Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
- Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
- Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
- Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
- Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
- Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).
