Uma estratégia para validar o papel da mediada por calejado Plasmodesmal Gating na Tropic Response

Summary

Este artigo descreve os métodos para o rastreio dos genes que controlam a permeabilidade plasmodesmal e inclinação, portanto, auxina durante a resposta trópico. Isto inclui a medição do grau de resposta trópico no hipocótilo da Arabidopsis thaliana e verificar a permeabilidade plasmodesmal pelo ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfónico carregamento (HPTS) e avaliação do nível de finalmente calejado.

Abstract

A auxina hormona vegetal desempenha um papel importante em muitos processos de crescimento e desenvolvimento, incluindo respostas trópico à luz e gravidade. O estabelecimento de um gradiente de auxina é um evento chave levando a phototropism e gravitropismo. Anteriormente, foi demonstrado polar do transporte de auxina (PAT) para estabelecer um gradiente de auxina em diferentes domínios celulares de plantas. No entanto, Han et ai. Demonstraram recentemente que a formação adequada gradiente de auxina, plasmodesmal conectividade symplasmic mediada por calose entre as células adjacentes é também um factor crítico. Neste manuscrito, a estratégia para elucidar o papel de genes específicos, que podem afetar phototropism e gravitropismo alterando a conectividade symplasmic através de modulação de síntese calejado plasmodesmal, é discutido. O primeiro passo é o despiste de respostas aberrantes trópico de 3 dias de idade de plântulas estioladas mutantes ou sobre-expressão de um gene linhas juntamente com o tipo selvagem. Este rastreio preliminarpodem levar à identificação de uma série de genes que funcionam em PAT ou controladores conectividade symplasmic. O segundo rastreio envolve a triagem dos candidatos que mostram respostas trópico alterada por afetar a conectividade symplasmic. Para lidar com tais candidatos, foi examinado o movimento de um marcador symplasmic e a deposição de calose plasmodesmal. Esta estratégia seria útil para explorar novos genes candidatos que podem regular a conectividade symplasmic directa ou indirectamente as respostas durante trópico e outros processos de desenvolvimento.

Introduction

Plantas, como organismos vivos sésseis, desenvolveram uma rede altamente sofisticada de sinalização de célula a célula para abordar vários estímulos ambientais. respostas Tropic são um dos fenômenos pelo qual as plantas respondem a estímulos ambientais. Plantas mostram dois principais trópico respostas, phototropism e gravitropismo. plantas fotossintéticas dobrar em direção à fonte de luz por phototropism para colher o máximo de energia. Da mesma forma, gravitropismo faz as plantas a crescer em direção ao centro da gravidade. O mecanismo fundamental que leva a tais respostas tropicais envolve a formação de gradiente assimétrica da auxina phytohormone ^1. O ato de formação de gradiente de auxina local está bem caracterizada; os genes que estão envolvidos neste mecanismo fornecem um roteiro para a ação do hormônio ^2-8. A posição específica de transportadores de efluxo de auxina, tais como o pino-formado (PIN) e P-glicoproteínas, executa o movimento de auxina a partir do citoplasma para a parede celular de células do doador ^9,10. Furthermore, pela actividade simporte ⁺ H activo / IAA de transportadores de influxo de auxina, tais como as proteínas da família AUX1 LAX /, auxina é finalmente entregue às células receptoras adjacentes ^2,11,12. Este movimento direcional da auxina é conhecido como transporte de auxina polar (PAT). PAT leva a uma distribuição diferencial de auxina durante vários estágios de desenvolvimento e em resposta a diferentes estímulos ambientais ^13,14. Além disso, a interrupção na localização ou a expressão de qualquer um destes transportadores de influxo ou efluxo de auxina conduz a uma alteração grave na PAT, o que provoca uma perturbação do gradiente de auxina, que conduz a defeitos de desenvolvimento. Recentemente, Han et ai. informou que a regulamentação plasmodesmal também é necessário para manter o gradiente de auxina ^15. Até à data, mais de 30 proteínas plasmodesmal foram identificados ^16. Entre estas proteínas, AtGSL8 foi classificado como uma enzima chave para a síntese de calose em plasmodesmos (PD) e, consequentemente, desempenha um papel vital na maintaining o limite de tamanho PD exclusão (SEL). Expressão AtGSL8 reprimida resultou em um padrão de gradiente auxina distorcida levando a nenhuma resposta trópico em contraste com mudas de tipo selvagem ^15.

Neste manuscrito, métodos para explorar novos genes candidatos que estão envolvidos na regulação do PD são fornecidos. AtGSL8 foi utilizado como uma proteína modelo para testar estes métodos, uma vez que é uma enzima chave contribuindo para PD biossíntese de calose. Devido à letalidade da plântula-gsl8 knock-out mutantes ^17, a dexametasona (DEX) linhas de ARNi -inducible foram usadas de acordo com um relatório publicado anteriormente ^15. A estratégia aqui fornecida pode ser adaptado para rastrear os genes que estão implicados na resposta hipocótilo trópico controlado por PD SEL.

Protocol

1. Seleção de mutantes com alterações da resposta fototrópicas e gravitrópico Prepare 1x Murashige e Skoog (MS) Médio, pH 5,7, com 0,8% Agar Um dia antes do experimento. Adicione 800 ml de água bidestilada a um frasco cónico de 2 L e mexa com uma barra magnética. Adicionar 4,4 g de sal de MS ao frasco cónico. Adicionar 0,5 g de 2- (N-morfolino) etano sulfónico (MES) e agita-se até que todos os sais sejam completamente dissolvidos. Ajustar o pH do meio a 5,7 …

Representative Results

Na configuração atual, dexametasona (DEX) -inducible linhas RNAi de AtGSL8 [daqui em diante dsGSL8 (+ dex / -Dex)] foram utilizados, como gsl8 homozigotos mutantes de inserção de T-DNA são mudas letal 18. Três dias de idade de plântulas estioladas dsGSL8 e mudas de tipo selvagem com Dex ± foram expostos a estímulos fototrópicos e gravitrópico. Descobrimos que dsGSL8 (+ dex) mudas eram defeituosos em phototropism e gravitr…

Discussion

Neste manuscrito, uma estratégia para a tela mutante / sobre-expressão linhas que são defeituosos nas respostas fototrópicas e gravitrópico devido a calejado PD alterada e, portanto, PD SEL é descrito em detalhes. a síntese e degradação de calose PD é conseguida principalmente por sintases de calose e β-1,3-glucanases, mas a regulação destes enzimas é controlada por muitos factores a montante. Para procurar tais factores a montante ou candidatos que estão diretamente envolvidos na regulação do PD, criá…

Materials

HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 mL glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri Dish (35×10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 x 125 x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds