우리는 귀 및 쥐의 꼬리에서 일차 섬유 아세포를 생성하기위한 간단하고 신속한 실험 절차를 설명한다. 절차는 특별한 동물 훈련을 필요로하지 않고, 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 배양 섬유 아세포의 생성을 위해 사용될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
차 세포는 조직에서 직접 파생 된 설립 세포주에 비해 생체 내에서 세포의 생리 학적 상태를보다 잘 나타내는 것으로 생각된다. 그러나, 일차 세포 배양 물은 일반적으로 제한된 수명을 가지며 빈번하게 재 확립 될 필요가있다. 섬유 아세포는 일차 전지의 쉽게 접근 할 수있는 소스입니다. 여기, 우리가 귀 마우스의 꼬리에서 차 섬유 아세포 문화를 확립하기 간단하고 빠른 실험 절차에 대해 설명합니다. 프로토콜은 최대 10 일 동안 실온에서 저장 귀에서 일차 섬유 아세포 배양을 확립하는데 사용될 수있다. 프로토콜에 따라 신중하게되면 오염은 일부 경우에 장시간 저장된 비 멸균 조직의 사용에도 불구하고 발생하기 어렵다. 섬유 아세포 문화에 빠르게 증식과 복제 성 노화가 진행되기 전에 상당한 숫자로 확장 할 수 있습니다.
서론
차 세포는 시험관 조건에서 조직 배양 생활에서 파생됩니다. 그것은 일반적으로 일차 전지가 더 밀접하게 생리 학적 상태와 그들이 불멸 또는 종양 세포 라인 1보다 시작된 조직의 유전 적 배경을 닮은 것으로 가정한다. 그 때문에, 일차 세포는 생물학적 질문 2,3-을 연구하는데 유용한 모델을 나타낸다. 그러나 무한정 성장 설립 세포 라인과는 달리, 일차 전지는 결국 문화의 노화를 받아야 자주 다시 설정해야합니다.
일반적으로 사용되는 세포는 일차 섬유 아세포, 상피 세포, 내피 세포, T 세포, B 세포, 골수 유래 대 식세포 (BMDM) 골수 유래의 수상 세포 (BMDC)를 포함한다. 섬유 아세포는 종종 일차 세포 배양 모델로서 이용된다. 그들은 다른 일차 전지를 통해 주요 장점을 제공합니다. 세포 배양은 쉽게 쉽게 유지, 설립 및 더의 purifica을 필요로하지 않습니다문화 이전에 세포의 기. 그들은 빠른 초기 확산 및 전문 매체 또는 정품 인증 프로토콜에 대한 요구 사항이 있습니다. 섬유 아세포를 효율적으로 생물학적, 화학적, 물리적 프로토콜을 사용하여 형질 4,5- 수있다. 세포 배양을 확립하기 전에 실온에서 최대 10 일 동안 귀를 저장하는....
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프로토콜
마우스는 euthanization까지 제도적 지침 (기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인 싱가포르 국립 대학과 실험 동물 연구를위한 국가 자문위원회 (NACLAR) 지침)을 준수 무균 상태에서 보관 하였다.
1. 마우스
- 해당 유전 적 배경 중 하나 마우스를 주문하십시오. 이 프로토콜은 하나의 C57BL / 6 마우스 유래의 조직에 기초한다.
완전 배지 2. 준비
- 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 50 μM 2- 머 캅토 에탄올, 100 μM 아스파라긴, 2 mM의 글루타민, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액 로즈웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 배지에하기 성분을 첨가함으로써 완전 배지를 준비한다.
효소 솔루션 3. 준비
- 15 ML 원뿔 바닥 튜브 콜라게나 D 솔루션을 준비합니다.
- 콜라게나 디 디의 10 mg의 무게4 용액에 ssolve 콜라게나 D 완전한 매체.
- 1.7 ml의 microcentrifuge 관에서 프로 나아 솔루션을 준비합니다.
- 프로 나제 10 mg의 무게.
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결과
조직 파편의 상당한 양의 조직 결과에서 섬유 아세포의 추출 (도 1). 조직 파편과는 대조적으로, 섬유 아세포는 1 일, 문화의 3 사이의 조직 배양 플라스틱 표면에 부착. 섬유 아세포 배양 매체는 안전하게 크게 문화 (그림 2)에서 파편 현재의 수준을 감소해야 문화의 3 일에 변경 될 수 있습니다. 섬유 아세포는 가늘고 긴 형태와 명확하게 볼 세포질 (그림 1과 2)를 표시합니다. 유사 분열 세포는 이후 문화의 3 일에서 존재해야하고 세포 배양 3 ~ 4 일 이내에 세포 자랄 때 70 ~ 80 %에 도달해야한다. 10cm 배양 접시에 귀와 꼬리 조직에서 수율은 4 5 10 × 5 (귀), 문화의 3 일에서 5 5 10 × 6 전지 (꼬리) 범위. 섬유 아세포의 분리에 이어 세 번째 날, 세포를 계대 배양 할 수 있고, 10cm 배양 접시 당 2 × 105 세포로 시딩.
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토론
여기에서 우리는 귀를 쥐의 꼬리에서 차 섬유 아세포 문화를 확립하기, 간단한 저렴하고 빠른 실험 절차를 제공합니다. 추출은 조직 3 일 후 격리 내에 부착하고 신속하게 분할하는 섬유 아 세포에서 발생한다. 일차 전지의 중요한 한계는 노화, 영구 성장 정지 15이다. 섬유 아세포는 노화되기 전에 프로토콜을 사용하여, 섬유 아세포 배양 크기 (2-3 배 증가) 및 확장 오류 증가, 세포의 평탄화에 의해 지시, 5 ~ 6 회 계대 될 수있다.
섬유 아 세포의 분리를 수행 할 때주의가 섬유 아세포의 낮은 복구가 발생합니다 불충분 절단 또는 소화로, 조직의 중단시 지불해야합니다. 이 섬유 아세포의 수를 증가 귀와 꼬리 섬유 아세포를 풀 수있다. 복막과 동일한 방식으로 처리 된 폐 조직을 포함하여 추가의 조직 (T)을 향상시키기 위하여 적당히 첨가 할 수있다섬유 아세포의 그는 수. 파편은 섬유 아 세포 추출 다음 문화에 존재하지만, 그것은 섬유 아세포는 세포 배양 접.......
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공개 사항
저자는 재정적 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 NRF 보조금 HUJ-CREATE - Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 | HyClone | SH30027.01 | |
| 태아 송아지 혈청 | HyClone | SV30160.03 | |
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마-알드리치 | M3148 | |
| 아스파라긴 | 시그마-알드리치 | A4159 | |
| 글루타민 | 시그마-알드리치 | G8540 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 하이클론 | SV30010 | |
| 에탄올 | Merck Millipore | 107017 | Absolute for analysis |
| Collagenase D | Roche Diagnostics | 11088866001 | From Clostridium histolyticum, 동결건조, 비멸균 |
| Pronase 프로테아제 | Merck Millipore | 53702 | Streptomyces griseus에서 |
| Tris 완충액(pH 8) | 1st BASE | 1415 | 초순수 등급 |
| 0.5M EDTA(pH 8) | 1st BASE | BUF-1053 | 생명공학 등급 |
| 10X 인산염 완충 식염수(PBS) | 1st BASE | BUF-2040-10X4L | 초순수 |
| 등급 Trypsin-EDTA 용액 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | 0.5% 트립신, 0.2% EDTA, 페놀 레드 없이 SER-TAIN 공정에 의해 조사된 트립신 감마, 식염수 |
| 암포테리신 B | 시그마-알드리치 | A2492-20ml | 250 μ g / ml를 탈 이온수, 멸균 여과 |
| 가위 | Aesculap | ||
| Forcep | Aesculap | AE-BD312R | |
| 0.2 μ M 주사기 필터 | Sartorius Stedim | 16534 | |
| 70 μ M 세포 여과기 | SPL | 93070 | |
| 주사기 플런저 | Terumo | SS+10L | |
| 극저온 튜브 | NUNC | 368362 | |
| 1.7 ml 마이크로 원심분리기 튜브 | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm 세포 배양 접시 | Greiner | 664160 | 세포 배양 처리 접시 |
| 15 ml 원뿔형 바닥 튜브 | Greiner | 188271 | |
| 50 ml 원뿔형 바닥 튜브 | Greiner | 227261 | |
| 수조 | GFL | 1002 | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5810R | |
| 배양 쉐이커 | Sartorius Stedim | Certomat-BS1 | |
| Zeiss Axiovert 25 광학 현미경 | Carl Zeiss AG |
참고문헌
- Fitzpatrick, L. E., McDevitt, T. C. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications. Biomater Sci. 3 (1), 12-24 (2015).
- Elenbaas, B., et al. Human breast cancer cells generated by oncogenic transformat....
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재인쇄 및 허가
