احتياطات السلامة وإجراءات التشغيل في (A) مختبر BSL-4: 2. الممارسات العامة
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
عمل في مختبر الاحتواء مستوى السلامة الحيوية 4 (BSL-4) يتطلب وقتا واهتماما كبيرا بالتفاصيل. فإن العمل نفسه الذي يتم في مختبر BSL-2 مع مسببات الأمراض غير عالية نتيجة أن تتخذ لفترة أطول كثيرا في إعداد BSL-4. هذه الزيادة في متطلبات الوقت ويرجع ذلك إلى العديد من العوامل التي تهدف إلى حماية باحث من العدوى المكتسبة من المختبر، وبيئة العمل من التلوث المحتمل والمجتمع المحلي من احتمال إطلاق سراحهم من مسببات الأمراض عالية نتيجة. داخل المختبر، يتم تقييد الحركة بسبب خراطيم الهواء تعلق على الدعاوى سلامة كامل الجسم إلزامية. وبالإضافة إلى ذلك، لا بد من تطهير كل بند من البنود التي تم إزالتها من خزانات الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية (BSCs). يجب تدريب المتخصصين مختبر في ممارسات مختبر BSL-4 ويجب أن تظهر عالية الكفاءة في المهارات التي تقوم بها. محور هذه المقالة هو لتوضيح الإجراءات والتقنيات لضمان مختبر ب المناسبةiosafety ودقة التجريبية باستخدام معيار فحص اللوحة الفيروسي كإجراء سبيل المثال. على وجه الخصوص، والتقنيات المناسبة للعمل بأمان في بيئة BSL-4 عند إجراء التجربة سيتم التركيز بصريا. وتشمل هذه التقنيات: إنشاء BSC الدرجة الثانية للتجارب، والتنظيف السليم للش.م.ب الدرجة الثانية عند الانتهاء من العمل، وإدارة النفايات والتخلص الآمن من النفايات المتولدة داخل مختبر BSL-4، وإزالة عينات المعطل من داخل BSL- 4 المختبر إلى المختبر BSL-2.
Introduction
كما سلامة العاملين في المختبرات التعامل مع مسببات الأمراض عالية نتيجة (أي مواد الوقاية عدوى ولا خيارات العلاج موجودة) أمر بالغ الأهمية، أنشأت وزارة الصحة والخدمات البشرية مبادئ توجيهية لتشييد مرافق وأفضل الممارسات لإجراء آمن للعمل مع مسببات الأمراض في الطب الحيوي و المختبرات الطبية من منظور السلامة الأحيائية 1. من خلال التشريع والتنظيم، وأصبحت العديد من الممارسات والإجراءات المتطلبات الإلزامية التي يجب اتباعها للعمل مع هذه الجراثيم. في الولايات المتحدة، مسببات الأمراض التي تنتقل بسهولة من شخص لآخر، تؤدي إلى ارتفاع معدلات إماتة الحالات، و / أو لديها القدرة على التأثير كبيرا على الصحة العامة والإرهاب البيولوجي، يتم تصنيفها على أنها المعهد الوطني لل/ معهد الصحة الوطني للحساسية والأمراض المعدية مرض (NIH / NIAID) الأولوية ألف مسببات الأمراض وأو مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC) الإرهاب البيولوجي الفئة (أ) وكلاء 2. وبالإضافة إلى ذلك، حيتم تصنيف مسببات الأمراض IGH-نتيجة في الفئة حدد وكلاء 1 إذا كانت هذه الجراثيم وكلاء الإرهاب البيولوجي المحتملة، لديهم احتمال سقوط ضحايا كتلة أو الآثار المدمرة للاقتصاد والبنية التحتية الحرجة، أو الثقة العامة 3.
BSL-4 عمليات، بما في ذلك الوصول إلى المعاهد مع BSL-4 المختبرات ويتم التحكم بدرجة أعلى من 2 BSL / 3 العمليات. على سبيل المثال، هو إلى حد كبير أكثر صعوبة للوصول إلى مختبر BSL-4 مقارنة مختبر BSL-2 أو بي إس 3 نظرا إلى متطلبات كبيرة تدريب دعوى، ومتطلبات الإرشاد واسعة، ومتطلبات إضافية للسلامة الأحيائية الطبية. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عادة الحواجز الأمنية الفعلية أكثر في منشأة BSL-4 مقابل مرفق BSL-2 أو BSL-04-06 مارس. كما هو مبين في المادة الأولى بالنسبة لنا على إجراءات BSL-4 الدخول والخروج، وموظفي المختبر الخضوع لتدريب مكثف والفحص النفسي للتأهل لدخول BSL-4 مختبر 7. Within المختبر BSL-4، وتجنب خطر العدوى والأخطاء أو التخفيف منها باتباع الإجراءات المعمول بها. البحث يجب المضي قدما بعناية وروية، مع الحد الأدنى من تعدد المهام أو الانحرافات. الانحناء في الدعاوى بالضغط الإيجابي من الصعب، ودرع الوجه قد تقيد إجراءات مثل المجهر. قفازات ضخمة تعوق أداء المهام الحركية الدقيقة، مثل التعامل مع أشياء صغيرة أو وصفها الأنابيب. لتقليل الوقت الذي يقضيه في BSL-4 مختبرات، يجب أن المتخصصين مختبر مراجعة إجراءات العمل لتحديد الخطوات التي يمكن القيام به قدما في مختبر BSL-2 ومن ثم نقل هذه المواد إلى المعمل BSL-4 لإنجاز المهمة (ق). عند إزالة المواد لمزيد من المعالجة في BSL-2 المختبر، يتم إصلاح المواد وإزالتها من مختبر BSL-4 في وعاء الثانوية مختومة. ومن أمثلة العينات التي قد تحتاج إلى إزالتها: لوحات أو أنابيب من مادة المصابة الثابتة التي سيتم تحليلها من قبل immunosorbe انزيم مرتبطالإقليم الشمالي فحص (ELISA)، المناعي فحص (IFA)، أو تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).
بالإضافة إلى مزيد من القيود المادية التي تفرضها معدات الوقاية الشخصية المطلوبة في BSL-4 مختبرات مقارنة مع أولئك في بي إس إل-2 المختبرات وإجراءات لتعطيل مسببات الأمراض عالية نتيجة في لوحات زراعة الخلايا والتخلص من النفايات هي أكثر صرامة من تلك اللازمة للبحث عن الفيروسات أقل المسببة للأمراض درس في مختبر BSL-2. كحد أدنى، ينبغي لهذه الأساليب تلبية الاحتياجات CDC. على سبيل المثال، لوحات زراعة الخلايا الملوثة وغيرها من المواد يمكن المعطل مع الكواشف الكيميائية، مثل الفورمالين محايدة مخزنة. تعامل لوحات ثقافة الخلية أو الأنابيب هي لتوضع في أكياس ختم الحرارة التي تحتوي على الفورمالين وإزالتها من المختبر عن طريق خزان دونك مليئة مطهر السائل. دلاء النفايات مليئة حلول مطهر والرش وتستخدم المطهرات لاستقبال النفايات المتولدة أثناء التجربة ولالديسي مؤقتاnfecting القفازات، وتنظيف الأسطح والأدوات المتعلقة بالسلامة الأحيائية مجلس الوزراء، على التوالي. يعتبر رباعي محلول مطهر الأمونيوم في تركيز سرد المعيار الذهبي لجميع مختبرات الولايات المتحدة BSL-4 (بر J، والاتصالات الشخصية، 2015). وتعقيمها النفايات الصلبة من دلو النفايات للقضاء على احتمالات التلوث.
في محاولة لإظهار بصريا سير العمل والقيود المفروضة على الإجراءات العامة BSL-4، استخدمنا معيار فحص اللوحة الفيروسي كمثال على إجراء الفيروسية شيوعا. في حين وصفت الإجراء الفحص الفيروسي بشكل عام، فإننا نؤكد على إجراءات السلامة البيولوجية المستخدمة لضمان سلامة العاملين في المختبرات في هذا البروتوكول. يرجى الرجوع إلى تصورات لوحة فحص الكلاسيكية السابقة لخلفية إضافية على تقنية 8،9 وحة الفحص.
الإجراءات المقدمة هنا تتبع مواصفات BMBL التي حددها CDC 1. ومع ذلك، فإن البروتوكولات المعروضة هيمحددة لIRF-فريدريك. كل مرفق BSL-4 ومختلف الإجراءات التشغيلية الموحدة (الأورام) وأساليب العمل التي تؤثر على تنفيذ تجارب في المختبر BSL-4. إجراءات بديلة لإدارة مجرى النفايات وتنفيذ فحوصات لوحة قد تختلف بناء على إدارة وتشغيل هذه المختبرات. ومع ذلك، فإن الفهم العام للالإعداد لBSL-4 دعوى المختبرات وإجراءات لأداء العمل مع الدرجة الثانية خزائن داخل بيئة BSL-4 تساعد العلماء على فهم القيود والآثار على السلامة عند التفكير في دراسات من مسببات الأمراض مخاطر عالية. زيادة الوعي من المتعاونين الخارجيين من الصعوبات المحيطة عمل في مختبر BSL-4 يمكن أن يؤدي إلى التوقعات المعدلة وسهولة أكبر في تطوير المضادة الطبية في الأوساط البحثية.
Protocol
Representative Results
Discussion
عمل في مختبر BSL 4 يتطلب قدرا كبيرا من الوقت ومزيدا من الاهتمام بالتفاصيل. أي نوع من العمل في هذه البيئة تتطلب تدريبا جيدا وشاملة، وأصحاب الضمائر الحية. يوفر معيار لوحة الفحص الفيروسي نموذجا دقيقا لإجراء شائع للعمل مع مسببات الأمراض عالية نتيجة في مختبر BSL-4، كما ينطوي ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
