安全注意事项和操作步骤在（A）BSL-4实验室：2.常规做法
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
在生物安全4级（BSL-4）封闭实验室工作需要时间，非常注重细节。这是在BSL-2实验室与非高病原后果做了同样的工作将在BSL-4设置显著更长的时间。这增加的时间要求是由于多种因素的旨在保护从实验室获得性感染，从潜在污染的工作环境和高病原后果可能释放当地社区的研究员。实验室内，运动由于连接到强制全身安全服空气软管的限制。此外，需要是从II级生物安全柜（的BSC）中除去每个项目的消毒。实验室专家必须在BSL-4实验室的做法进行培训，必须表现出他们正在执行的技能熟练度高。本文的重点是勾勒出合适的程序和技术，以确保实验室biosafety和实验精度使用标准病毒噬菌斑测定，例如，过程。特别是，适当的技术，在BSL-4环境中安全工作的时候进行实验将在视觉上强调。这些技术包括：建立II级BSC的实验中，当完成工作的二类BSC的正确的清洁，废物管理和无害化处理的BSL-4实验室内产生的废物，并从里面BSL-去除灭活样本4实验室到BSL-2实验室。
Introduction
由于实验室人员处理高后果的病原体的安全性（无感染预防就也没有治疗方案存在）是最重要的，健康和人类服务的美国部门已建立了设施建设和工作的安全行为准则的最佳实践，在生物医学病原体和从生物安全的角度来看1临床实验室。通过立法和监管，许多做法和程序已成为强制性要求必须遵守与这些病原体的工作。在美国，这很容易从人与人之间传播的病原体，导致高病死率，和/或具有重大公共卫生影响和生物恐怖主义的潜力，被归类为过敏和传染病的健康/国立研究所病（NIH / NIAID）排序的一种病原体和或疾病控制中心和预防中心（CDC）生物恐怖A类代理商2。此外，H如果这些病原体是潜在的生物恐怖制剂，有大量人员伤亡和毁灭性影响到经济，重要基础设施，或公众信心3 IGH潜力，后果的病原体被列为一级代理商选择。
BSL-4行动，包括访问院所BSL-4实验室，更高度控制比BSL-2/3的操作。例如，它是基本上更难以获得由于大量西装培训要求，广泛指导要求，以及额外的医疗生物安全的先决条件访问BSL-4实验室相比，BSL-2或BSL-3实验室。此外，还有典型的一个BSL-4设施与一个BSL-2或BSL-3设施4-6多个物理安全屏障。正如我们在第一篇文章中概述了BSL-4出入境手续，实验室工作人员进行广泛的培训和心理筛查资格进入的BSL-4实验室7。 W¯¯ithin的BSL-4实验室，感染和错误的风险是可以避免的，或者按照既定程序缓解。研究必须细心谨慎进行，以最小的多任务处理或分心。在正压力服弯腰是困难的，并且面罩可能限制方法如显微术。笨重的手套阻碍了精细动作的任务，如搬运小件物品或标记管的性能。为了最大限度地减少在BSL-4的实验室所花费的时间，实验室专家应该检查的工作程序，以确定可以提前在BSL-2实验室中进行的步骤，然后传输这些材料进BSL-4实验室的任务（多个）的完成。在BSL-2实验室中除去以进行进一步处理的材料时，材料是固定的，从在密封次级容器的BSL-4实验室除去。可能需要被删除的样本的实例包括：将通过酶联immunosorbe被分析的固定板或感染材料的管核苷酸测定（ELISA），免疫荧光测定（IFA）或聚合酶链反应（PCR）。
除了通过在BSL-4实验室所需的个人防护设备施加较大的物理限制相比，那些在BSL-2实验室中，为了在细胞培养板和废物处置高后果病原体灭活程序比所需更少致病病毒严格研究了一个BSL-2实验室。在最低限度，这些方法应符合CDC要求。例如，受污染的细胞培养板和其他材料可以与化学试剂，如中性缓冲的福尔马林灭活。处理过的细胞培养板或管是通过填充有液体消毒剂扣篮罐被放入含有福尔马林热封袋和除去从实验室。废物桶填充有消毒液和喷雾消毒剂用于暂时接收该实验期间和DISI产生的废物nfecting手套，清洁生物安全柜表面和仪器，分别为。在列出的浓度消毒剂季铵溶液被认为是所有美国BSL-4实验室（巴尔Ĵ，个人通信，2015年）的黄金标准。从废物桶固体废物灭菌，以消除污染的可能性。
在努力目视证明工作流和普通BSL-4程序的限制，我们使用了一个标准的病毒噬菌斑测定作为常用的病毒程序的一个例子。而病毒检测程序在一般描述中，我们强调用来保证在本协议中的实验室人员的安全生物安全程序。请参考以前的古典牌匾检测为可视化的斑块检测技术8,9更多的背景。
这里介绍的程序遵循疾病预防控制中心1中列出的BMBL规范。然而，所提出的协议是具体到IRF-弗雷德里克。每个BSL-4设备具有的BSL-4实验室内影响实验的执行标准不同操作程序（SOP）和操作方法。废物流管理和斑块检测的执行替代程序可能会有所不同基于这些实验室的管理和运作。尽管如此，BSL-4实验室的西装，为BSL-4环境中与表演类II工作程序橱柜的设置一个大致的了解将有助于考虑高风险的病原体研究时，科学家们理解的制约因素和安全隐患。增加的周围在BSL-4实验室工作中的困难外协作者的认识可导致调整的预期并在研究团体显影医疗对策更容易。
Protocol
Representative Results
Discussion
在BSL-4实验室工作，需要大量的时间和更多的对细节的关注。在这种环境中的任何类型的工作，需要训练有素，深入，认真的人。标准的病毒斑块检测提供了一个共同的过程的精确模型与在BSL-4实验室后果严重病原体的工作，作为测定包括在实验室工作人员必须经过培训，几个主要的概念。
第一个主要概念是在II类BSC，其功能为高病原后果一级容器的正确使用和安全操作的应?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
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