Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 2. Allgemeine Practices
Summary
Performing viral assays in a BSL-4 laboratory is more involved compared to work in a BSL-2 laboratory due to required additional safety precautions. Here, we present an overview of practices and procedures used inside a BSL-4 laboratory illustrating proper Class II biosafety cabinet usage, waste management/disposal, and sample removal.
Abstract
Die Arbeit in einem Biosicherheitsstufe 4 (BSL-4) Eindämmung Labor erfordert Zeit und viel Liebe zum Detail. Die gleiche Arbeit, die in einem BSL-2 Labor mit Nicht-Hoch Folge Krankheitserreger wird erheblich länger dauern in einem BSL-4-Einstellung erfolgt. Diese erhöhte Zeitbedarf ist aufgrund einer Vielzahl von Faktoren, die auf den Schutz der Forscher vom Labor erworbenen Infektionen, die Arbeitsumgebung vor möglichen Kontamination und der lokalen Gemeinschaft von möglichen Freisetzung von hoch Folge Krankheitserreger gerichtet sind. Innerhalb Labor wird die Bewegung durch Luftschläuche an die vorgeschriebene Sicherheitsanzüge Ganzkörper befestigt beschränkt. Zusätzlich Desinfektion von jedem Element, das von der Klasse II Biosicherheit Schränke (BSCs) entfernt wird, ist nicht erforderlich. Labor Spezialisten müssen in der Praxis der BSL-4 Labor geschult werden und eine hohe Kompetenz in den Fähigkeiten zeigen, müssen sie durchführen, sind. Der Schwerpunkt dieses Artikels ist die richtige Verfahren und Techniken zu umreißen Labor b, um sicherzustellen,iosafety und experimentelle Genauigkeit eines Standard viralen Plaque-Test als Beispiel Verfahren. Insbesondere arbeiten die richtigen Techniken sicher in einem BSL-4-Umgebung bei der Durchführung eines Experiments wird visuell hervorgehoben werden. Diese Techniken umfassen: die Einrichtung einer Klasse-II-BSC für Experimente, die richtige Reinigung der Klasse II BSC wenn Sie fertig sind Arbeiten, Abfallwirtschaft und sicheren Entsorgung von Abfällen in einem BSL-4 Labor erzeugt, und die Entfernung von inaktivierten Proben aus dem Inneren eines BSL- 4 Labor auf den BSL-2 Labor.
Introduction
Als Sicherheit von Hoch Folge Erregern Laborpersonal Handhabung (keine Infektion Prophylaxe noch existieren Behandlungsmöglichkeiten) an erster Stelle steht, hat das US Department of Health and Human Services Richtlinien festgelegt für Anlagenbau und Best Practices für die sichere Durchführung von Arbeiten mit Krankheitserregern in der biomedizinischen und klinische Laboratorien aus einer Biosicherheit Perspektive 1. Durch Gesetze und Vorschriften, haben viele der Praktiken und Verfahren verbindlichen Anforderungen werden, die für die Arbeit mit diesen Erregern befolgt werden müssen. In den USA, Krankheitserreger, die sich leicht von Mensch zu Mensch übertragen werden, führen zu hohen Letalitätsraten und / oder das Potenzial für große öffentliche Gesundheit auswirken und Bioterrorismus haben, werden als National Institute of Health / National Institute of Allergy kategorisiert und Infektions Krankheit (NIH / NIAID) Priorität A Pathogene und oder Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorismus Kategorie A Agents 2. Zusätzlich hIGH-Folge Krankheitserreger werden als Tier – 1 – Agenten auswählen klassifiziert , wenn diese Erreger potenzielle Bioterrorismus Mittel sind, haben das Potenzial für Massenanfall von Verletzten oder verheerende Auswirkungen auf die Wirtschaft, die kritische Infrastruktur oder das Vertrauen der Öffentlichkeit 3.
BSL-4-Operationen, einschließlich des Zugangs zu den Instituten mit BSL-4 Laboratorien sind höher gesteuert als BSL-2/3-Schaltungen. Zum Beispiel ist es wesentlich schwieriger, Zugang zu einem BSL-4 Labor zu gewinnen im Vergleich zu einem BSL-2 oder BSL-3 Labor aufgrund erheblicher Anzug Ausbildungsanforderungen, umfangreiche mentorship Anforderungen und zusätzliche medizinische Biosicherheit Voraussetzungen. Darüber hinaus gibt es typischerweise mehrere physische Sicherheitssperren in einem BSL-4 – Anlage im Vergleich zu einem BSL-2 oder BSL-3 – Anlage 4-6. Wie bereits in unserem ersten Artikel über BSL-4 Ein- und Ausstieg beschriebenen Verfahren, durchlaufen Laborpersonal eine umfassende Ausbildung und psychologische Screening für den Eintritt in den BSL-4 Labor 7 zu qualifizieren. Within der BSL-4 Labor, Infektionsrisiko und Fehler werden vermieden oder durch folgende etablierten Verfahren gemildert. Die Forschung muss sorgfältig und bewusst mit minimaler Multitasking oder Ablenkungen gehen. Bücken im Überdruckanzüge ist schwierig, und der Gesichtsschutz Verfahren beschränken, wie Mikroskopie. Sperrige Handschuhe behindern die Leistung der Feinmotorik Aufgaben, wie Umgang mit kleinen Gegenständen oder Kennzeichnung Rohre. Zur Zeit verbrachte in BSL-4 Laboratorien zu minimieren, sollten Laborspezialisten Arbeitsabläufe überprüfen Schritte zu identifizieren, die vor uns in einem BSL-2 Labor durchgeführt werden kann und transportieren dann diese Materialien in die BSL-4 Labor für die Durchführung der Aufgabe (n). Wenn Materialien für die Weiterverarbeitung in BSL-2 Labor entfernen, werden die Materialien festgelegt und von der BSL-4-Labor in einem abgedichteten zweiten Behälter entfernt wird. Beispiele von Proben, die umfassen können entfernt werden müssen: Festplatten oder Rohre aus infiziertem Material, das durch enzyme-linked analysiert werden immunosorbent-Assay (ELISA), Immunfluoreszenztest (IFA), oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Neben der besseren physikalischen durch persönliche Schutzausrüstung auferlegten Beschränkungen erforderlich BSL-4 Laboratorien im Vergleich zu denen in BSL-2 Laboratorien, Verfahren zur Inaktivierung von Hoch Folge Pathogenen in Zellkulturplatten und Entsorgung sind strenger als die für weniger pathogenen Viren benötigt in einem BSL-2 Labor untersucht. Zumindest sollten diese Verfahren CDC Anforderung zu erfüllen. Beispielsweise kontaminierte Zellkulturplatten und anderen Materialien, können mit chemischen Reagenzien, wie neutral-gepuffertem Formalin inaktiviert werden. Behandelten Zellkulturplatten oder Rohre sind in Heißsiegelbeutel gelegt werden, die Formalin und entfernt vom Labor über einen dunk Tank mit einem flüssigen Desinfektionsmittel gefüllt ist. Abfall Eimer mit Desinfektionslösungen gefüllt und Spray Desinfektionsmittel eingesetzt werden zur vorübergehenden Abfall während des Experiments und für disi erzeugt Empfangnfecting Handschuhe, Reinigung Biosicherheitsschrank Flächen und Instrumenten sind. Quartären Ammoniumdesinfektionslösung in der Konzentration aufgeführt ist der Goldstandard für alle US-BSL-4 Laboratorien (Barr J, persönliche Mitteilung, 2015) betrachtet. Feste Abfälle aus einem Abfallbehälter autoklaviert Potential für Verunreinigung zu beseitigen.
In einer Anstrengung, um visuell den Arbeitsablauf und die Grenzen der allgemeinen BSL-4-Verfahren zu demonstrieren, verwendeten wir eine Standard viralen Plaque-Assay als ein Beispiel für eine häufig verwendete virale Verfahren. Während der viralen Assay-Verfahren im Allgemeinen beschrieben wird, betonen wir die Biosicherheit Verfahren Sicherheit des Laborpersonals in diesem Protokoll verwendet, um sicherzustellen. Bitte beziehen sich auf frühere klassische Plaque – Assay – Visualisierungen für zusätzliche Hintergrund auf dem Plaque – Assay – Technik 8,9.
Die Verfahren präsentiert hier folgen Sie den BMBL umrissenen Spezifikationen von CDC 1. Jedoch sind die vorgestellten Protokollespezifisch für das IRF-Frederick. Jede BSL-4-Anlage verfügt über verschiedene Standardarbeitsanweisungen (SOPs) und Methoden der Operation, die die Durchführung von Experimenten in der BSL-4 Labor auswirken. Alternative Verfahren für die Abfallstrom-Management und Durchführung von Plaque-Assays können auf die Verwaltung und den Betrieb dieser Labors, unterschiedlich sein. Dennoch wird ein allgemeines Verständnis für den Aufbau eines BSL-4-Anzug Labor und Verfahren für die Durchführung der Arbeit mit der Klasse II Schränke im Inneren des BSL-4-Umgebung den Wissenschaftlern helfen, die Einschränkungen und Auswirkungen auf die Sicherheit verstehen, wenn Studien mit hohem Risiko Krankheitserreger betrachten. Eine stärkere Sensibilisierung der externe Mitarbeiter der Schwierigkeiten in einem BSL-4 Labor umgebende Arbeit kann bei der Entwicklung von medizinischen Gegenmaßnahmen in der Forschungsgemeinschaft angepassten Erwartungen und größerer Leichtigkeit führen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Arbeit in einem BSL-4 Labor erfordert viel Zeit und zusätzliche Aufmerksamkeit zum Detail. Jede Art von Arbeit in diesem Umfeld erfordert gut ausgebildete, gründlich und gewissenhaft Einzelpersonen. Die Standard-Virus-Plaque-Test liefert ein genaues Modell eines gemeinsamen Verfahrens für die mit hoher Folge Krankheitserregern in der BSL-4 Labor, wie der Test mehrere wichtige Konzepte beinhaltet, in dem Laborpersonal geschult werden müssen.
Die erste große Konzept ist die richtige V…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the US Department of Health and Human Services (DHHS) or of the institutions and companies affiliated with the authors. This work was funded in part through Battelle Memorial Institute’s prime contract with the US National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) under Contract No. HHSN272200700016I. M.R.H., D.P., L.B., K.J. and J.W. performed this work as employees of Battelle Memorial Institute. Subcontractors to Battelle Memorial Institute who performed this work are: S.M. as an employee of MRI Global; M.G.L. as an employee of Lovelace Respiratory Research Institute, Inc.; and J.H.K. as an employee of Tunnell Government Services, Inc.
Materials
| Micro-Chem Plus | National Chemical Laboratories | 255 | |
| Ethanol | Fisher | BP2818500 | |
| 2-ml 96-Deep Well Plates | Fisher | 278743 | |
| 10-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11E | |
| 25-ml Serological Pipette | Fisher | 13-678-11 | |
| 6-well plates | Fisher | 140675 | |
| Crystal Violet | Sigma | HT90132-1L | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 22-050-105 | |
| Tragacanth | Fisher | 50-702-2000 | |
| 20-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-550 | |
| 200-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-561 | |
| 1000-μl Pipette Tips | Fisher | 21-402-581 | |
| DMEM | Lonza | 12-604Q | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | |
| Penicillin/Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| 2X EMEM | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Pipettor | Drummond | 4-000-101 | |
| 1000-μl Pipette | Rainin | L-1000XLS+ | |
| 200-μl Pipette | Rainin | L-200XLS+ | |
| 12-Well, Multichannel 200-μl Pipettor | Rainin | L12-200XLS+ | |
| 8-Well, Multichannel 1000-μl Pipettor | Rainin | LA8-1200XLS | |
| Attest | Express Medical Supplies | MMM12192 | |
| Autoclave | Getinge | GEB 2404 AMB-2 | |
| Autoclave Bag | Fisher | 01-828E | |
| 2000-ml Beaker | Fisher | 02-591-10H | |
| Autoclave Tray | Fisher | 13-359-20B | |
| Pipette Tray | Fisher | 13-361-5 | |
| 37°C Incubator | Fisher | WU-39321-00 | |
| Biohazard Can | Rubbermaid Commercial | FG614500 RED | |
| Autoclave Tape | Fisher | 15-903 | |
| Autoclave Rod | Made by IRF Facility | N/A | |
| Light Box | Fisher | S11552 | |
| Heat Sealer | Fisher | NC9793612 | |
| Heat Seal Pouches | Fisher | 01-812-25H | |
| Biohazard Bag | Fisher | 01-828E |
References
- Shurtleff, A. C., et al. The impact of regulations, safety considerations and physical limitations on research progress at maximum biocontainment. Viruses. 4, 3932-3951 (2012).
- de Kok-Mercado, F., Kutlak, F. M., Jahrling, P. B. The NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Appl Biosafety. 16, 58-66 (2011).
- Keith, L., Moyer, B. R., Cheruvu, N. P. S., Hu, T., et al. Preclinical imaging in BSL-3 and BSL-4 envrionments: imaging pathophysiology of highly pathogenic infectious diseases. Pharmaco-imaging in drug and biologics development. , (2014).
- Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Laboratory Suite Entry and Exit Procedures. J Vis Exp. , (2015).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. , e52065 (2014).
- Gonzalez-Hernandez, M. B., Bragazzi Cunha, J., Wobus, C. E. Plaque assay for murine norovirus. J Vis Exp. , e4297 (2012).
- Alfson, K. J., et al. Particle to plaque-forming unit ratio of Ebola virus influences disease course and survival in cynomolgus macaques. J Virol. , (2015).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the filovirus plaque assay for use in preclinical studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Blow, J. A., Dohm, D. J., Negley, D. L., Mores, C. N. Virus inactivation by nucleic acid extraction reagents. J Virol Methods. 119, 195-198 (2004).
