Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Summary

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Abstract

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Introduction

Die Beseitigung bestimmter Zellen, ohne dass andere Zellen zu schädigen ist extrem schwierig, vor allem in den etablierten Gewebe, und es besteht ein dringender Bedarf für eine Zelle Eliminationsverfahren im Tissue-Engineering-Bereich. Heute auf dem Gebiet der regenerativen Medizin, Gewebekulturen embryonale Stammzellen (ES), pluripotente Stammzellen (PSCs) oder induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) sind vielversprechende Materialien ¹ unter Verwendung von ^{– 3.}

Obwohl diese Geweberegeneration vielversprechend ist, eine Kontamination mit unerwünschten Zellen ist ein wichtiges Anliegen. Darüber hinaus gibt es ein Sicherheitsproblem von tumorigenicity nach der Transplantation ^4,5. Obwohl viele Studien zu diesen Themen konzentriert haben spezifische Zellen zu beseitigen, vor allem in der regenerativen Medizin ^{6 – 8,} hat keine praktische Methode entwickelt worden.

Nah-Infrarot-photoimmunotherapy (NIR-PIT) ist eine Behandlung, basierend auf einem Antikörper-Photoabsorptions conjugate (APC). Eine APC besteht aus einem zellspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) und einem Photoabsorptionsmittel, IR700. IR700 ist ein hydrophiles Derivat Siliciumdioxid-Phthalocyanin und nicht induziert Phototoxizität von selbst ^9. IR700 ist kovalent an den Antikörper über Amidreste an der Seitenkette von Lysin-Moleküle konjugiert. Die APC bindet Zielmoleküle auf der Zellmembran und induziert dann fast sofort Zellnekrose nach Einwirkung von NIR-Licht bei 690 nm. Während der Einwirkung von NIR-Licht, die Zellmembran reißt , was zu Zelltod ^9-14. NIR-PIT hat sich mit mehreren Antikörpern oder Antikörperfragmente , um wirksam zu sein, einschließlich anti-EGFR, anti-HER2, Anti-PSMA, anti-CD25, anti-Mesothelin, Anti-GPC3 und Anti-CEA ^15-21. Daher NIR-PIT kann gegen eine Vielzahl von Zielmolekülen verwendet werden. Darüber hinaus ist NIR-PIT eine gut kontrollierte Behandlung, die durch die Einschränkung der NIR-ligh selektive Behandlung bestimmter Regionen erlaubtt Bestrahlung ^18,22.

Hier stellen wir ein Verfahren zur spezifischen Zelleliminierung mittels NIR-PIT aus gemischten 3D-Kulturen.

Protocol

Hinweis: Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte spezifischen Zellen unter Verwendung von NIR-PIT zu beseitigen. Kontrollen und andere Details über NIR-PIT und die Lebensfähigkeit der Zellen kann an anderer Stelle 18 zu finden. 1. Konjugation von IR700 monoklonale Antikörper (mAb) Bereiten Sie mAb von Interesse bei 2-5 mg / ml in 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,6) Lösung. Mischungs 6,8 nmol von mAb mit 30,8 nmol von 10 mM IR700 in 0,1 M Na …

Representative Results

Um optisch die Wirkung von NIR-PIT überwachen, die A431-Zelllinie, die EGFR überexprimiert wurde genetisch modifiziert, um auch GFP und Luciferase (A431-luc-GFP) exprimieren. Als Nicht-Ziel von NIR-PIT wurde die Balb / 3T3-Zelllinie optisch modifiziert RFP (3T3-RFP) zum Ausdruck bringen. Die APC, Panitumumab-IR700 (pan-IR700), synthetisiert. Misch Sphäroide, die aus verschiedenen Verhältnissen von Zellen (A431-luc-GFP und 3T3-RFP) zusammengesetzt wurden , wurden gemäß diesem Protok…

Discussion

Wir veranschaulichen ein Verfahren zur spezifischen Zellelimination aus einer gemischten 3D-Zellkultur ohne Schaden an Nicht-Zielzellen durch NIR-PIT verwenden. Bisher gibt es keine praktische Methode der Zellelimination, wenn das Gewebe hergestellt wird oder nach der Transplantation. So NIR-PIT ist eine vielversprechende Methode, dies zu erreichen. Diese Technik könnte auch in vivo ^18,22 verwendet werden, da APCs eine ähnliche Pharmakokinetik wie mAb selbst zeigen. Die Zielzelltyp kann mi…

Materials

IRDye 700DX Ester Infrared Dye	LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)	929-70011
Na2HPO4	SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)	S9763
Sephadex G25 column (PD-10)	GE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)	17-0851-01
Coomassie (bradford) Plus protein assay	Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, USA)	PI-23200
Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates	3D Biomatrix Inc (Ann Arbor, MI, USA)	HDP1096-8
Optical power meter	Thorlabs (Newton, NJ, USA)	PM100
LED: L690-66-60	Marubeni America Co. (Santa Clara, CA, USA)	L690-66-60
Vectibix (panitumumab)	Amgen (Thousand Oaks, CA, USA)
35mm glass bottom dish, dish size 35mm, well size 10mm	Cellvis (Mountain View, CA, USA)	D35-10-0-N