Large-scale 2D electron microscopy (EM), or nanotomy, is the tissue-wide application of nanoscale resolution EM. Here we describe a universal method for nanotomy applied to investigate the zebrafish larval brain in health and upon non-invasive brain injury.
Storstilet 2D elektronmikroskopi (EM), eller nanotomy, er vævet-bred anvendelse af nanoskala elektronmikroskopi. Andre, og vi tidligere anvendte skala EM store til human hud pancreas-øer, vævskultur og hele zebrafisk larver 1-7. Her beskriver vi en universelt anvendelig metode til væv-skala scanning EM for saglig påvisning af sub-cellulære og molekylære funktioner. Nanotomy blev påført undersøge den sunde og en neurodegenerativ zebrafisk hjerne. Vores metode er baseret på standardiserede EM prøveforberedelse protokoller: Fiksering med glutaraldehyd og osmium, efterfulgt af epoxy-harpiks indlejring, ultratynd sektionering og montering af ultratynde-sektioner på én-hullers net, efterfulgt af indlæg farvning med uranyl og bly. Store 2D EM mosaik billeder har erhvervet under anvendelse af en scanning EM forbundet til et eksternt stort område scan generator i scanning transmission EM (STEM). Stor målestok EM billeder er typisk ~ 5 – 50 G pixels In størrelse, og ses bedst ved hjælp zoomable HTML-filer, som kan åbnes i en webbrowser, svarende til online geografiske HTML maps. Denne metode kan anvendes på (human) væv, tværsnit af hele dyr samt vævskultur 1-5. Her blev zebrafisk hjerner analyseret i en ikke-invasiv neuronal ablation model. Vi visualiserer inden for en enkelt datasæt væv, cellulære og subcellulære ændringer, som kan kvantificeres i forskellige celletyper, herunder neuroner og mikroglia, hjernens makrofager. Desuden nanotomy letter korrelationen af EM med lysmikroskopi (CLEM) 8 på det samme væv, som store overfladearealer tidligere afbildes med fluorescerende mikroskopi, kan efterfølgende underkastes stort område EM, hvilket resulterer i nano-anatomi (nanotomy) af væv. I alt nanotomy tillader uvildig detektion af bekvemmeligheder på EM-niveau i et væv-dækkende kvantificerbar måde.
Den seneste tekniske udvikling har forbedret alsidighed, anvendelighed og kvantitativ karakter af EM, hvilket fører til en genoplivning af ultrastrukturelle analyse. Fremskridt omfatter 3D EM, storstilet 2D EM og forbedrede fremgangsmåder og reagenser til korreleret lysmikroskopi og elektronmikroskopi (CLEM) at sammenligne andre former for mikroskopisk analyse direkte til EM niveau 8-10. Storstilet 2D EM er særligt velegnet til at kvantificere eller identificere (nye) sygdom funktioner til menneskelig patologi, studere dyremodeller for sygdom og vævskultur modeller. På grund af den typisk lille synsfelt er det svært at korrelere ændringer ved stor forstørrelse til et væv bred skala, samt at unbiasedly og kvantitativt analysere ultrastrukturelle træk.
For patologisk analyse af humant væv eller vurdering af patologi i dyremodeller, hæmatoxylin og eosin (H & E) farvede sektioner af formaldehyd fast paraffin indstøbt (FFPE) tissagsøge er standarden. Udover simple H & E farvning immunolabeling også udføres for at identificere patologiske abnormiteter. Hvis sådanne væv kunne analyseres på EM-niveau, specifikke celletyper, og kunne identificeres subcellulære ændringer. Den objektiv karakter skala EM stort tillader at finde uventede og hidtil ukendte træk ved sygdommen. Ved storstilet kan visualiseres EM områder op til kvadratmillimeter. Vi og andre tidligere har anvendt nanotomy at rotte pancreas-øer 4, cellekultur 2, rotte hjerne 3, hud og slimhinder 7 og hele zebrafisk larver 1,5 (www.nanotomy.org). Zebrafisk er særdeles egnede til in vivo-billeddannelse, i særligt at visualisere celletyper, som er vanskeligt tilgængelige i mammale væv, herunder hjerne immunceller 11. Her proceduren nanotomy er beskrevet detaljeret, påført på koronale sektioner af zebrafisk hoveder undergår betinget neuronal ablation ved omdannelse af metronidazol ved neuronaludtrykt nitroreduktase (www.nanotomy.org) 5,12-14. Alle rådata præsenteres som zoomable HTML-filer, visualisering molekylær væv omfattende ændringer. Præsentationen af de rå data tillader upartiske analyser af datasæt fra andre vinkler af eksperter verden over.
EM tillader analyse af cellulær sammenhæng med høj opløsning billeddannelse af makromolekyler i biologiske sammenhæng. Men dette typisk begrænser synsfeltet. Større skala 3D EM er særligt velegnet til kortlægning neuronal konnektivitet ved at skabe nanoskala resolution 3 dimensionelle rekonstruktioner, der kræver kompleks databehandling 10. I modsætning hertil 2D stor skala EM kræver kun et enkelt afsnit og syning af billeddata, og vurdering af data er muligt af alle med adgang til en Internet browser. Vi og andre tidligere anvendte skala EM stor til at analysere væv og hele dyr. Som for de fleste tilgange, TEM og SEM-baserede syning har deres egne fordele. Her blev scanning transmission EM (STEM), der anvendes, der tillader dannelsen af et stort synsfelt ved høj opløsning. Typisk en STEM billede svarer til de synsfelter på ca. 100 TEM billeder, en markant reduktion af mængden af syning, når billeddannelse stor fields synspunkter i høj opløsning. Hvis der er behov højere opløsning, kan TEM være fordelagtig. STEM har den fordel i forhold TEM, at ikke-kontrast prøver kan anvendes med god ultrastrukturel kontrast 6.
Derudover kan den her beskrevne fremgangsmåde kan simpelthen tilpasses til anvendelse med tilbagespredt elektrondetektion (BSD) på Section monteret på silica wafers, udvidet brug til flere mikroskopsystemer. HTML-zoomable væv EM-filer er meget nyttige for kvantificering, deling af data, der ikke kan have været analyseret til sin fulde indhold, der kombinerer LM og EM data (Clem) 8, præsentationsformål i videnskabelig forskning, at analysere patientdata, og for uddannelse. Alternativt i stor skala EM i et SEM, men ikke i en TEM, silica vafler kan anvendes, som har to fordele kan anvendes BSD, som er mere generelt tilgængelige på scanning-elektronmikroskop end STEM detektion. For det andet, montering af store dele (> 1 mm 2 områder irenter) er ligetil. Montering på enkelt slidsede gitre er arbejdskrævende og teknisk udfordrende. Detaljeret sammenligning mellem TEM, SEM og STEM er detaljeret andetsteds 6. En ulempe ved BSD billeddannelse er, at i forhold til STEM, billeder har øget støj. Dette kan delvis kompenseres ved at forøge pixel opholdstid, hvilket resulterer i meget længere indfangningstider.
Selv for prøveforberedelse relativt standard EM behandling (fiksering, indlejring og sektionering) er nødvendig 5-7, det er teknisk udfordrende at skære store ultratynde sektioner helt blottet for artefakter. Sektioner er meget skrøbelige og kan nemt knække, fold eller ødelagt under billedbehandling, hvilket typisk tager flere timer pr datasæt. Men på grund af den online deling af de rå uvildige data, hvis det bliver muligt lettere at sammenligne med offentliggjorte data, og bruge offentliggjort datasæt i det åbne område som kontroller. I øjeblikket få EM-enheder i stand til laRGE-skala-analyse er i brug, og derfor adgang til denne teknik er noget begrænset, selvom de fleste billeddannende centre velkomne fælles indsats.
For store sektioner skal være ordentligt fast i hele prøven vævet. Derfor er en blanding af den hurtige, men moderat fiksativ PFA anvendes i kombination med den langsomme, men stærk fiksativ GA. Skæring og picking up store dele uden artefakter er vanskelig. Arbejde med vafler i kombination med BSD er lettere i forhold til at samle sektioner på enkelt hul net. Heavy metal efter farvningen er mere kritisk i forhold til klassisk EM. Da hele afsnittet afbildes hver artefakt vil være synlig. TEM-brugere typisk har svært ved at skifte til en SEM, på grund af forskellen i mikroskop drift.
Kvantificering og datadeling – Kvantificering subcellulære funktioner er svært i enkelte EM billeder. Muligheden for at zoome ind og ud af storebilleder let identifikation af celler af interesse, som kan følges af nanoskala målinger inde i cellerne. Disse datasæt viser, at bestemte celletyper hurtigt kan identificeres og kvantificeres i en fordomsfri måde i disse store vævssnit, baseret på funktioner påviselige i forskellige målestoksforhold. For eksempel mikroglia kan identificeres på grundlag af deres morfologi og tætte cytoplasma. Efterfølgende ved at zoome ind på de enkelte celler, nanoskala subcellulære og molekylære funktioner i disse celler kan måles i samme datasæt, som vi tidligere viste for ER bredde inden for en storstilet EM vævskultur datasæt 2. En yderligere fordel ved nanotomy er, at hosting af skala datasæt store online vil tillade andre at inspicere data, måske for andre funktioner, og drage deres konklusioner om ny hypotese.
CLEM – Ud over at lette kvantitativ EM, skala EM store gør det nemmere at korrelere lys microscopic mærkning til EM-niveau 8. I det foreliggende eksempel er vist tilstedeværelsen af fagocytiske mikroglia i en zebrafisk ablation model. Et stort spørgsmål i neurovidenskab er, hvad de enkelte funktioner og bidrag er af mikroglia og potentielle andre kilder til fagocyterende og immunceller. Tidlige EM undersøgelser har vist markante subcellulære træk mikroglia i sygdom 18. Desværre er det svært at selektivt mærke mikroglia navnlig i en patologisk indstilling, de udviser stor overlapning med andre immunceller i genekspression, morfologi og funktion. Det er derfor uklart, om og hvornår mikroglia på ultrastrukturelle niveau adskiller sig fra immunceller fra andre kilder, herunder monocytafledt infiltrerende makrofager. Forståelse, om der er ultrastrukturelle forskelle mellem disse celler vil give et udgangspunkt for analyse af funktionelle forskelle. Kombination selektive transgene eller udtryk markører og CLEM tillader itfdeling af ultrastrukturelle funktioner selektiv til specifikke befolkningsgrupper.
Diagnose & præsentation og uddannelse – Ved at visualisere nanoskala til mikroskala inden for en enkelt datasæt EM data lettes meget til et bredt publikum. Med de øgede muligheder og værktøjer til korrelativ og storstilet EM forventer vi en genoplivning af EM i grundlæggende og medicinsk forskning. Vores metode er repræsenteret her påføres en zebrafisk hjerneskade model 5, men har været anvendt på humant væv 7, rottehjerne 3, i en rotte model for diabetes 4 og i cellekultur 2, og kan også anvendes i kombination med et TEM -baseret tilgang 1 viser alsidigheden af denne fremgangsmåde. Mikroskopet operatør ikke længere optagelse højt valgt, og dermed partiske billeder, men alle mange ultrastrukturelle funktioner registreres og åben for verdensomspændende analyse.
The authors have nothing to disclose.
Flertal af arbejdet er udført på UMCG og Billeddannelse Center (UMIC), der er sponsoreret af NWO 175-010-2009-023 og ZonMw 91.111.006; STW "Mikroskopi Valley 12718" til BNGG. Dette arbejde blev sponsoreret af en ZonMw VENI tilskud, et Marie Curie karriere integration tilskud (besparelse døende neuroner) og en Alzheimer Nederland stipendium til TJvH
Chemicals | |||
Low melting point agarose | VWR | 444152G | |
tricaine | Sigma | E10521 | |
Triton- X-100 | Sigma | X100 | |
glutaraldehyde | Polysciences | 1909 | |
Sodium cacodylate | Sigma | C0250 | |
osmiumtetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19114 | |
potassiumferrocyanide (K4[Fe(CN)]6) | Merck | 4984 | |
ethanol | VWR | 20821.365 | |
uranyl acetate | Merck | 8473 | |
sodiumtetraborate | Merck | 1063808 | |
Tolduidene blue | Merck | 1273 | |
Basic Fuchsin | BDH | 340324 | |
Lead citrate | BDH | discontinued | |
EPON | |||
2-dodecenylsuccinicacid anhydride | Serva | 20755 | |
methylnadic anhydride | Serva | 29452 | |
glycid ether 100 | Serva | 21045 | |
DMP-30 | Polysciences | 553 | |
Standard flat embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70901 | |
diamond knife | Diatome Inc. | ||
copper grids | Electron Microscopy Sciences | ||
double sided carbon tape | Electron Microscopy Sciences | ||
Scanning EM Zeiss Supra55 | Zeiss | ||
ultramicrotome Leica EM UC7 | Leica | ||
Atlas external scan generator | Fibics |