Um método rápido e eficiente para a purificação de células da endoderme Gerado de células estaminais embrionárias humanas
Summary
Aqui, descrevemos um método para a purificação de células-tronco embrionárias humanas diferenciadas que estão comprometidos para a endoderme definitiva para a melhoria das aplicações a jusante e outras diferenciações.
Abstract
As capacidades de diferenciação de células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) permitem uma aplicação terapêutica potencial para terapias de substituição de células. Terminalmente tipos de células diferenciadas pode ser utilizado para o tratamento de várias doenças degenerativas. Diferenciação in vitro destas células no sentido de tecidos do pulmão, fígado e pâncreas requer como um primeiro passo na geração de células da endoderme definitivas. Este passo é para a posterior diferenciação em direcção tipos de células terminalmente maturados tais como células beta produtoras de insulina, hepatócitos, ou outros tipos de células derivadas de endoderme limitante da velocidade. As células que são comprometidas com a linhagem endoderme altamente expressar uma grande variedade de factores de transcrição, tais como Foxa2, Sox17, HNF1B, membros da família GATA, e o receptor da superfície CXCR4. No entanto, os protocolos de diferenciação são raramente de 100% eficiente. Aqui, nós descrevemos um método para a purificação de uma população de células CXCR4 + após a diferenciaçãona DE usando microesferas magnéticas. Esta purificação remove adicionalmente células de linhagens indesejados. O método de purificação suave é rápido e fiável e pode ser usado para melhorar as aplicações a jusante e diferenciações.
Introduction
As células estaminais pluripotentes, tais como células estaminais embrionárias (CES) têm a capacidade de se diferenciar em virtualmente qualquer tipo de células do corpo humano. Assim, os protocolos in vitro de diferenciação podem ser usadas para gerar numerosos tipos de células, tais como adultos cardiomiócitos 1, 2 hepatócitos, células beta 3, 4 ou epitelial de pulmão de células neuronais 5. Isso faz com que os CES uma ferramenta valiosa para o tratamento potencial de várias doenças degenerativas 3.
A diferenciação in vitro dos CES no sentido de tecidos adultos do pulmão, fígado e pâncreas requer um pseudo-gastrulação em células reminiscentes da endoderme definitivo (DE) 6. Uma vez que a diferenciação em direcção a jusante dos tipos de células somáticas atrás referidos é significativamente menos eficiente, uma endoderme diferenciação óptima é considerada como a taxa de limitação 7. As células que estão comprometidos para com a linhagem endoderme submeter chamudanças racteristic em seu perfil de expressão gênica. Genes reguladores mestre pluripotência são regulados negativamente, enquanto que a expressão de outros factores de transcrição tais como Foxa2, Sox17, HNF1B, membros da família GATA e o receptor da superfície CXCR4 é altamente regulada positivamente 6, 8, 9. CXCR4 é conhecido por ser transactivado por Smad2 / 3, a jusante de sinalização Nodal / TGF-β e Sox17 devido a locais de ligação específicos na sua região promotora 10. Assim, é um marcador muito adequado utilizado num certo número de relatórios de 6, 8, 11-13. Estas mudanças de expressão reflete um evento pseudo-gastrulação, em que os CES primeiro adquirir características de uma população de células streak-like primitivo e posteriormente comprometer na camada germinativa endoderme 6.
No entanto, os protocolos de diferenciação são raramente de 100% eficiente como algumas células podem resistir ao processo de diferenciação ou diferenciar em relação a outras linhagens não intencionais 14. Estas células podem Influe negativamentemaior diferenciação nce. Além disso, as células indiferenciadas residuais abrigar grandes riscos para experiências de transplante mais tarde e pode dar origem a teratomas 15-17.
Para remover estas células indesejadas cedo-CXCR4 na superfície marcador pode ser utilizado para a purificação de células que estão comprometidos para a DE 18. Aqui, nós descrevemos um método para a selecção positiva de células CXCR4 + a partir de culturas de diferenciação de ED. Para isso, o CXCR4 marcador de superfície está ligada por um anticorpo o qual, em seguida, por sua vez, liga-se a microesferas magnéticas. Ao contrário das condições adversas durante a separação por FACS, as células como DE-magneticamente marcadas podem então ser facilmente purificadas em um formato de bancada utilizando um método de purificação suave. Este protocolo proporciona um método simples para a remoção das populações de células que resistiram ao processo de diferenciação DE.
Protocol
Representative Results
Discussion
protocolos de diferenciação utilizados actualmente raramente resultam em células diferenciadas 100%. Por razões que ainda têm de ser abordadas algumas células resistir ao processo de diferenciação. Dependendo da eficiência do protocolo utilizado diferenciação e a propensão do CES alinhar um certo número de células pluripotentes residuais são vulgarmente observadas mesmo após a diferenciação em endoderme definitiva. Estas células residuais pode prejudicar diferenciações a jusante ou uma análise mais…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A assistência técnica hábil de Jasmin Kresse é reconhecido agradecimento.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
References
- Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P.W., Wu, S.M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
- Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
- Naujok, O., Burns, C., Jones, P.M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet? Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
- Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
- Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
- Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
- D'Amour, K.A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
- Kim, P.T., Ong, C.J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55 303-319 (2012).
- Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
- Nostro, M.C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Bruin, J.E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Fu, W., Wang, S.J., Zhou, G.D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W.J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
- Hentze, H., Soong, P.L., Wang, S.T., Phillips, B.W., Putti, T.C., Dunn, N.R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
- Herberts, C.A., Kwa, M.S., Hermsen, H.P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 29 (2011).
- Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
- Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W.H., Baker, J.C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), e17536 (2011).
