En rask og effektiv metode for rensing av endoderm celler generert fra humane embryonale stamceller
Summary
Her beskriver vi metode til rent differensierte humane stamceller som begått mot definitive endoderm for forbedring nedstrøms søknader og ytterligere differentiations.
Abstract
Differensieringen egenskapene til pluripotente stamceller som embryonale stamceller (ESCs) tillate en potensiell terapeutisk anvendelse for celle erstatning terapi. Terminalt differensierte celletyper kan brukes for behandling av forskjellige degenerative sykdommer. In vitro differensiering av disse cellene overfor vev i lunger, lever og bukspyttkjertel krever som et første trinn dannelsen av definitive endodermal celler. Dette trinnet er hastighetsbegrensende for ytterligere differensiering mot døds modnet celletyper som insulinproduserende betaceller, leverceller eller andre endoderm-avledet celletyper. Celler som er begått mot endoderm avstamning sterkt uttrykke et mangfold av transkripsjonsfaktorer som FOXA2, SOX17, HNF1B, medlemmer av GATA familien, og overflaten reseptor CXCR4. Men differensiering protokoller er sjelden 100% effektiv. Her beskriver vi en fremgangsmåte for rensing av en CXCR4 + cellepopulasjon etter differensieringinn i DE ved hjelp av magnetiske mikroperler. Dette rensing fjerner tillegg celler av uønskede linjer. Den milde rensemetode er rask og pålitelig og kan brukes til å forbedre nedstrøms applikasjoner og differensieringer.
Introduction
Pluripotente stamceller slik som embryonale stamceller (ESCS) har evnen til å differensiere i praktisk talt en hvilken som helst celletype av menneskekroppen. Således kan in vitro differensiering protokoller brukes til å generere en rekke voksen celletyper som for eksempel kardiomyocytter 1, hepatocytter 2, beta-cellene 3, lunge epitelial 4 eller 5 nevronale celler. Dette gjør ESCs et verdifullt verktøy for potensiell behandling av ulike degenerative sykdommer 3.
Den in vitro differensiering av ESCs mot voksent vev i lunge, lever og bukspyttkjertel krever en pseudo-gastrulation inn i celler som minner om den definitive endoderm (DE) 6. Siden nedstrøms differensiering mot de nevnte somatiske celletyper er betydelig mindre effektiv, er en optimal endoderm differensiering regnes som hastighetsbegrensende 7. Celler som er begått mot endoderm avstamning gjennomgå chagent endringer i genekspresjon profilen. Pluripotency stam regulatoriske gener er nedregulert, mens ekspresjonen av andre transkripsjonsfaktorer slik som FOXA2, SOX17, HNF1B, medlemmer av Gata familien og den overflatereseptoren CXCR4 er sterkt oppregulert 6, 8, 9. CXCR4 er kjent for å være transactivated ved SMAD2 / 3, nedstrøms Nodal / TGF-β signalering og SOX17 skyldes spesifikke bindingssteder i sin promoter region 10. Således er det et svært egnet markør som brukes i en rekke rapporter 6, 8, 11-13. Disse uttrykk endringene reflekterer en pseudo-gastrulation hendelse, der ESCs først få egenskapene til en primitiv strek-lignende cellepopulasjon og deretter begå inn i endoderm bakterie lag 6.
Men differensiering protokoller er sjelden 100% effektiv som noen celler kan motstå differensiering prosess eller skille mot andre utilsiktede linjene 14. Disse cellene kan ha negativ influensaNCE ytterligere differensiering. Videre gjenværende udifferensierte celler båtplass stor risiko for senere transplantasjon eksperimenter og kan gi opphav til teratomas 15-17.
For å fjerne disse uønskede celler tidlig på overflaten markør CXCR4 kan brukes for rensingen av celler som er begått mot DE 18. Her beskriver vi en fremgangsmåte for positiv utvelgelse av CXCR4 + -celler fra DE differensierings kulturer. For dette er den overflatemarkør CXCR4 bindes av et antistoff, som deretter i sin tur binder seg til magnetiske mikrokuler. I motsetning til de tøffe forholdene under FACS sortering, de magnetisk merket DE-lignende celler kan da lett bli renset i en benkeplate Bøk format med en mild rensemetode. Denne protokollen tilveiebringer en grei metode for fjerning av cellepopulasjoner som motsto DE differensieringsprosessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
For tiden anvendes differensieringsprotokoller sjelden resultere i 100% differensierte celler. Av grunner som fortsatt må tas opp noen celler motstå differensieringsprosessen. Avhengig av effektiviteten av den brukte protokoll differensiering og tilbøyelighet til ESC linje et visst antall av gjenværende pluripotente celler blir ofte observert selv etter differensiering til den definitive endoderm. Disse gjenværende cellene kan svekke nedstrøms differentiations eller videre analyse som transcriptomics, proteomikk o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den dyktige teknisk assistanse av Jasmin Kresse er takknemlig erkjent.
Materials
| Hues8 human embryonic stem cell line | Harvard Department of stem cell & regenerative biology | NA | Suitable cell line for endoderm generation |
| Hes3 human embryonic stem cell line | ES Cell International | NA | Suitable and robust cell line for endoderm generation |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 5850 | ESC culture medium |
| FCS | Biowest | S1860 | |
| Advanced RPMI 1640 | Life Technologies | 12633012 | |
| CD184 (CXCR4)-APC, human | Miltenyi Biotec | 130-098-357 | |
| anti-APC MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| OctoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | magnetic field |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ROCK inhibitor |
| CHIR-99021 | Tocris Bioscience | 4423 | |
| Activin A | Peprotech | 120-14 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stemcell Technologies | 7174 | Enzyme-free passaging solution, alternative: Trypsin/EDTA |
| Matrigel* | Corning | 354277 | basement membrane matrix * solve and store in aliquots at -80 °C as outlined in the suppliers manual. Upon use, thaw on ice, dilute in 25 ml ice-cold knockout DMEM/F-12. Add 1 ml to each well of a 6-well plate and incubate for 45 min at room temperature. Remove the matrigel and use immediately. |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 30-042-201 | |
| MACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Human FOXA2 FW gggagcggtgaagatgga |
Life Technologies | NA | |
| Human FOXA2 REV tcatgttgctcacggaggagta |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC FW gaggagaaagtggaggtctggtt |
Life Technologies | NA | |
| Human GSC REV ctctgatgaggaccgcttctg |
Life Technologies | NA | |
| SOX17 TaqMan assay | Applied Biosystems | Hs00751752_s1 | |
| Human SOX7 FW gatgctgggaaagtcgtggaagg |
Life Technologies | NA | |
| Human SOX7 REV tgcgcggccggtacttgtag |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 FW cttgctgcagaagtgggtggagg |
Life Technologies | NA | |
| Human POU5F1 REV ctgcagtgtgggtttcgggca |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog FW ccgagggcagacatcatcc |
Life Technologies | NA | |
| Human Nanog REV ccatccactgccacatcttct |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP FW caa cag cct gcc acc tta cgc tc |
Life Technologies | NA | |
| Human TBP REV agg ctg tgg ggt cag tcc agt g |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A FW ggc agt gtt tgt aga ctt gga acc c |
Life Technologies | NA | |
| Human TUBA1A REV tgt gat aag ttg ctc agg gtg gaa g |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD FW agg ccg tca cca aga aca ttc a |
Life Technologies | NA | |
| Human G6PD REV cga tga tgc ggt tcc agc cta t |
Life Technologies | NA | |
| Anti-SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320 | |
| Anti-FOXA2 | MerckMillipore | 07-633 | |
| Anti-SOX17 | R&D Systems | AF1924 | |
| NA = not applicable |
References
- Sharma, A., Li, G., Rajarajan, K., Hamaguchi, R., Burridge, P.W., Wu, S.M. Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation. J Vis Exp. (97), (2015).
- Sgodda, M., et al. Improved hepatic differentiation strategies for human induced pluripotent stem cells. Curr Mol Med. 13 (5), 842-855 (2013).
- Naujok, O., Burns, C., Jones, P.M., Lenzen, S. Insulin-producing surrogate beta-cells from embryonic stem cells: are we there yet? Mol Ther. 19 (10), 1759-1768 (2011).
- Katsirntaki, K., et al. Bronchoalveolar sublineage specification of pluripotent stem cells: effect of dexamethasone plus cAMP-elevating agents and keratinocyte growth factor. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 669-682 (2015).
- Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
- Naujok, O., Diekmann, U., Lenzen, S. The generation of definitive endoderm from human embryonic stem cells is initially independent from activin A but requires canonical Wnt-signaling. Stem Cell Rev. 10 (4), 480-493 (2014).
- D'Amour, K.A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Diekmann, U., Lenzen, S., Naujok, O. A reliable and efficient protocol for human pluripotent stem cell differentiation into the definitive endoderm based on dispersed single cells. Stem Cells Dev. 24 (2), 190-204 (2015).
- Kim, P.T., Ong, C.J. Differentiation of definitive endoderm from mouse embryonic stem cells. Results Probl Cell Differ. 55 303-319 (2012).
- Katoh, M., Katoh, M. Integrative genomic analyses of CXCR4: transcriptional regulation of CXCR4 based on TGFbeta, Nodal, Activin signaling and POU5F1, FOXA2, FOXC2, FOXH1, SOX17, and GFI1 transcription factors. Int J Oncol. 36 (2), 415-420 (2010).
- Nostro, M.C., et al. Stage-specific signaling through TGFbeta family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells. Development. 138 (5), 861-871 (2011).
- Rezania, A., et al. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).
- Bruin, J.E., et al. Maturation and function of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors in macroencapsulation devices following transplant into mice. Diabetologia. 56 (9), 1987-1998 (2013).
- Fu, W., Wang, S.J., Zhou, G.D., Liu, W., Cao, Y., Zhang, W.J. Residual undifferentiated cells during differentiation of induced pluripotent stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (4), 521-529 (2012).
- Hentze, H., Soong, P.L., Wang, S.T., Phillips, B.W., Putti, T.C., Dunn, N.R. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Res. 2 (3), 198-210 (2009).
- Herberts, C.A., Kwa, M.S., Hermsen, H.P. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 29 (2011).
- Naujok, O., Kaldrack, J., Taivankhuu, T., Jörns, A., Lenzen, S. Selective removal of undifferentiated embryonic stem cells from differentiation cultures through HSV1 thymidine kinase and ganciclovir treatment. Stem Cell Rev. 6 (3), 450-461 (2010).
- Pan, Y., Ouyang, Z., Wong, W.H., Baker, J.C. A new FACS approach isolates hESC derived endoderm using transcription factors. PLoS One. 6 (3), e17536 (2011).
